糖尿病腎病（DN）是2型糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。該病表現(xiàn)出明顯的家族聚集性和單核苷酸多態(tài)性（SNP）遺傳力，但其具體的遺傳風(fēng)險機(jī)制尚不明確。以往針對糖尿病腎病的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）在識別遺傳風(fēng)險位點(diǎn)和估計遺傳力方面成果有限，這可能是因為這些研究主要基于臨床表型診斷的DN患者，而非經(jīng)腎活檢確診的DN病例。此外，不同種族群體在DN發(fā)生和進(jìn)展中存在差異，增加了遺傳研究的復(fù)雜性，使得遺傳位點(diǎn)難以在不同人群中得到一致驗證。目前大多數(shù)DN的GWAS研究集中于非裔美國人或白人群體，針對中國漢族人群的研究仍較為缺乏，限制了我們對該人群DN發(fā)病機(jī)制的理解。

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心劉志紅院士領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊在Cell子刊《Cell Reports Medicine》在線發(fā)表題為“Multimodal analysis stratifies the genetic susceptibility and reveals the pathogenic mechanism of kidney injury in diabetic nephropathy”的文章。研究聯(lián)合國內(nèi)12家單位，成功構(gòu)建了目前全球最大規(guī)模、經(jīng)腎活檢明確診斷為DN的精準(zhǔn)表型隊列。以此為基礎(chǔ)，首次繪制了中國漢族人群DN患者遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)了10個新的DN疾病風(fēng)險SNP位點(diǎn)；其中5個具有很高的因果可能性，其中TCN2中的錯義變異（p.K77M）是最佳候選者。隨后的多維分析表明，與腎小管間質(zhì)損傷相關(guān)的遺傳變異是導(dǎo)致DN易感性的關(guān)鍵因素。此外，體外和體內(nèi)實(shí)驗證實(shí)，TCN2 p.K77M誘導(dǎo)線粒體功能障礙，在高糖條件下加劇腎小管細(xì)胞損傷。研究闡明了經(jīng)活檢證實(shí)的DN的遺傳結(jié)構(gòu)，并為其發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。該研究使用的Tcn2-flox(C57BL/6JGpt-Tcn2em1Cflox/Gpt,T020717)和Tcn2-K77M(C57BL/6JGpt-Tcn2em1Cin(K77M)/Gpt)小鼠均由集萃藥康制作。

建立精確表型的腎活檢確診DN隊列和嚴(yán)格篩選的對照組

為了最大程度降低臨床表型定義的DN隊列中難以避免的其他腎臟疾病的干擾，采用了嚴(yán)格的臨床與病理表型篩選方案，腎活檢證實(shí)DN的患者作為DN組，以及診斷為10年以上無微量白蛋白尿、腎功能異常和DR的T2D患者作為T2D組，最終的DN組包括2,279名經(jīng)腎活檢證實(shí)的DN的無關(guān)患者。對于T2D組，篩查了15,895 名被診斷患有糖尿病且10年以上且無任何微血管并發(fā)癥的患者。通過眼底照相和腎功能評估（例如估計腎小球濾過率（eGFR）和尿白蛋白與肌酐比值（UACR））確定T2D患者是否存在微血管并發(fā)癥。此外，我們還招募了一個HC組，該組由3,970名沒有糖尿病和腎臟疾病的人組成。最終研究人群包括10,011名不相關(guān)的參與者，包括2,279名DN患者、3,762名T2D患者和3,970名健康個體。

圖1. 選擇糖尿病腎病組（DN組）、2型糖尿病對照者（T2D組）和健康對照者（HC組）的過程

兩階段GWAS設(shè)計和Meta分析

通過兩階段GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了10個達(dá)到全基因組顯著水平的DN遺傳易感位點(diǎn)，并且新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)與既往DN GWAS研究結(jié)果存在顯著差異，不僅提示中國漢族人群可能具有獨(dú)特的DN遺傳易感背景，也有力地支持了精準(zhǔn)表型DN隊列在揭示核心致病位點(diǎn)上的優(yōu)勢。結(jié)果顯示，免疫系統(tǒng)紊亂和消化系統(tǒng)紊亂顯著富集。這種富集主要是由位于HLA位點(diǎn)附近的遺傳變異以及PSORS1C1、TCN2和EEF1D位點(diǎn)驅(qū)動的。

圖2. Stepwise GWAS與post-GWAS分析

精細(xì)定位和因果變異推斷

研究在GWAS分析中，與T2D相比，包括HLA-DQB1和HLA-B在內(nèi)的幾個HLA等位基因顯示出與DN的顯著關(guān)聯(lián)。因此，進(jìn)一步關(guān)注HLA區(qū)域中最重要的關(guān)聯(lián)信號，以確定T2D中DN易感性的潛在致病變異。應(yīng)用了FINEMAP在GWAS中確定的10個提示性位點(diǎn)中優(yōu)先考慮DN與T2D的變異，這些變異可能在單變異水平上是因果關(guān)系。在這10個基因座中，有5個因果關(guān)系的概率大于50%。后驗概率大于99%的是TCN2外顯子2中的錯義變異（rs75680863;c. 230A>T;p.K77M）。

與臨床特征相關(guān)的致病變異的基因型和腎組織表達(dá)

為了評估5種致病變異的臨床相關(guān)性，研究者檢查了它們與DN中腎損傷標(biāo)志物的相關(guān)性，特別是eGFR和蛋白尿。效應(yīng)等位基因rs75680863和rs118096913與蛋白尿增加相關(guān)，支持這兩種變異的致病作用，而其他三種候選致病變異與蛋白尿沒有顯著關(guān)聯(lián)。分析表明，腎小管TCN2 mRNA表達(dá)與eGFR呈正相關(guān)，但與蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，表明TCN2對DN患者具有腎保護(hù)作用。相反，PSORS1C1、LIF和HLA-B的較高表達(dá)水平與eGFR降低和蛋白尿增加相關(guān)，表明這些基因的較高表達(dá)可能有助于疾病進(jìn)展。這些結(jié)果凸顯了這些候選位點(diǎn)及其相關(guān)基因在DN腎功能惡化中的重要性。

圖3. 五個優(yōu)先基因位點(diǎn)與 DN 臨床特征的基因型和腎臟組織表達(dá)關(guān)聯(lián)

與腎臟病理特征相關(guān)的致病變異的基因型和腎組織表達(dá)

腎臟形態(tài)學(xué)是DN的診斷和預(yù)后金標(biāo)準(zhǔn)。評估了精細(xì)定位的位點(diǎn)是否影響了1,891名DN患者的DN腎臟病理學(xué)，并提供了可用的病理數(shù)據(jù)。通過比較每個候選變異的基因型類別中每個病理類別的比例，我們確定間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮（IFTA）和間質(zhì)炎癥嚴(yán)重程度與變異基因型表現(xiàn)出顯著關(guān)聯(lián)（p<0.05）。rs75680863（TCN2）基因型顯示出最強(qiáng)的IFTA關(guān)聯(lián)。

圖4. 優(yōu)先基因位點(diǎn)的基因型和腎臟組織表達(dá)與腎臟病理特征之間的關(guān)聯(lián)

構(gòu)建TCN2條件性敲除和TCN2 p.K77M點(diǎn)突變小鼠模型

具體而言，TCN2主要在近端腎小管細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在DN下顯著下調(diào)。多模式方法將轉(zhuǎn)錄譜與DN病理學(xué)聯(lián)系起來，優(yōu)先考慮以TCN2為例的遺傳風(fēng)險特征。rs75680863是TCN2基因外顯子2的錯義突變（c.230A>T， p.Lys77Met），是DN的關(guān)鍵風(fēng)險位點(diǎn)。為了進(jìn)一步探討rs75680863（TCN2 p.K77M）在DN發(fā)育中的作用，研究者建立了Tcn2-K77M突變小鼠模型與Tcn2條件性敲除小鼠模型，并誘導(dǎo)其發(fā)展為糖尿病腎病模型，發(fā)現(xiàn)Tcn2的敲除或點(diǎn)突變能夠加重小鼠的糖尿病腎病相關(guān)表型。

圖5. TCN2 K77M小鼠及其糖尿病模型的表型及病理變化

線粒體功能測定和蛋白質(zhì)組學(xué)分析

與WT小鼠相比，Tcn2-K77M小鼠線粒體蛋白表達(dá)降低，包括線粒體復(fù)合物亞基、線粒體核糖體蛋白、線粒體膜蛋白和線粒體合酶。這些蛋白質(zhì)在WT糖尿病和Tcn2-K77M糖尿病小鼠中持續(xù)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在高糖條件下，線粒體在Tcn2-K77M小鼠的管狀細(xì)胞中受損并失調(diào)。

圖6. TCN2效應(yīng)等位基因加劇高糖條件下腎小管細(xì)胞的線粒體缺陷

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)為理解中國漢族人群DN的發(fā)病機(jī)制提供了新見解，并為DN的精準(zhǔn)診斷和治療提供了潛在靶點(diǎn)。研究建立的精確表型篩選方法和多維度分析策略也為其他復(fù)雜疾病的遺傳研究提供了重要參考。