2023年3月，南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院閆超教授、陳迪俊教授聯(lián)合南京鼓樓醫(yī)院劉翔宇主任團(tuán)隊(duì)在Nature Neuroscience在線發(fā)表題為“Lipid-accumulated reactive astrocytes promote disease progression in epilepsy”的研究論文。該研究采用集萃藥康B6/JGpt-Apoeem1Cd82/Gpt、B6/JGpt-Apoeem1Cflox/Gpt-Aldh1l1em1Cin(CreERT2)/Gpt小鼠，首次報(bào)道了一種脂質(zhì)堆積的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（LARA）在癲癇病發(fā)病中的重要作用以及致病機(jī)理，揭示了LARA以APOE依賴的方式形成，加劇神經(jīng)元的過度興奮，促進(jìn)癲癇病發(fā)展進(jìn)程，為耐藥TLE治療提供新思路。

1、顳葉癲癇患者及癲癇病小鼠模型腦內(nèi)脂質(zhì)異常積聚

研究者首先分析了4位耐藥TLE（最常見的局灶性癲癇形式）患者核磁共振波譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與正常側(cè)相比，TLE患者致癇側(cè)中檢測到脂質(zhì)信號(hào)明顯增加，表明脂質(zhì)在癲癇腦中異常積聚。接下來，研究者利用免疫熒光染色以及脂質(zhì)組學(xué)分析的方法發(fā)現(xiàn)在耐藥TLE患者的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中脂質(zhì)積累水平顯著增加。

隨后通過向小鼠的海馬區(qū)及腹腔注射海人酸（KA）誘導(dǎo)小鼠癲癇模型，然后通過組織熒光染色、脂質(zhì)組學(xué)分析以及電鏡切片觀察等方法證實(shí)了癲癇小鼠出現(xiàn)了與TLE患者相似的結(jié)果，即神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中脂質(zhì)出現(xiàn)異常積聚，但在小膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞并沒有。

人和鼠的數(shù)據(jù)均表明，大腦中脂質(zhì)的過度積聚是癲癇的一個(gè)重要病理特征（圖1）。

圖1.癲癇患者和小鼠模型的異常脂質(zhì)積聚

2、單核RNA測序揭示顳葉患者星形膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝異常和APOE上調(diào)

為了探究異常的脂堆積是否會(huì)導(dǎo)致脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化，研究者使用TLE患者（n=4）和非TLE對(duì)照（n=4）的腦皮層樣本進(jìn)行了單核RNA測序（snRNA-seq），分析發(fā)現(xiàn)TLE實(shí)驗(yàn)組的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)和代謝相關(guān)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被顯著激活，在神經(jīng)元被適度激活；進(jìn)一步的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TLE患者脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因APOE（編碼載脂蛋白E）在星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著高表達(dá)。

這些數(shù)據(jù)表明，顳葉患者星形膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝異常，并確定APOE是參與這一過程的關(guān)鍵基因（圖2a）。

圖2.單核RNA測序揭示顳葉患者星形膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝異常和APOE上調(diào)

3、APOE介導(dǎo)脂質(zhì)從神經(jīng)元到星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

為了探究APOE高表達(dá)是否是星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)堆積的必要條件，研究者首先對(duì)APOE?/?小鼠注射KA誘導(dǎo)癲癇，并評(píng)估了施加KA刺激后21dAPOE敲除小鼠海馬區(qū)脂質(zhì)積聚的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KA刺激僅輕微影響了APOE?/?小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元脂滴（LDs）的形成；而海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)積聚在很大程度上被阻斷，表明APOE是星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)積聚所必需的，而非神經(jīng)元中的脂質(zhì)堆積所必需的。

圖3.癲癇小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)積聚需要APOE

基于上述結(jié)果，研究者假設(shè)，在慢性癲癇條件下，脂質(zhì)最初在神經(jīng)元中積累，然后通過APOE依賴性機(jī)制持續(xù)轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者首先開展了體外實(shí)驗(yàn)。將野生型或APOE?/?小鼠的原代海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)KA刺激能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元過度激活從而釋放脂肪酸（FAs），釋放的FAs會(huì)被臨近的星形膠質(zhì)細(xì)胞吸收，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度積聚；而當(dāng)施加KA刺激APOE?/?小鼠神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中僅觀察到較低的脂質(zhì)積累水平（圖3）。

接下來，研究者通過將ALDH1L1-CreERT2小鼠與APOE flox小鼠雜交，實(shí)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中 特異性敲除APOE。在KA刺激下APOE條件性敲除鼠表現(xiàn)出星形膠質(zhì)細(xì)胞鐘LDs積累顯著減少，而神經(jīng)元的脂質(zhì)積累水平?jīng)]有明顯變化。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，在癲癇條件下，APOE介導(dǎo)脂質(zhì)從神經(jīng)元向星形膠質(zhì)細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)（圖4）。

圖4.星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除APOE阻斷癲癇小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)積聚

4、顳葉癲癇患者反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的分子譜分析

那么這群高表達(dá)APOE并且脂異常堆積的星形膠質(zhì)細(xì)胞是否是一種特定的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群？

研究者依據(jù)對(duì)照組和TLE患者的單核RNA測序比對(duì)數(shù)據(jù)將星形膠質(zhì)細(xì)胞群體分為六個(gè)亞群，分析發(fā)現(xiàn)，其中A4亞群既表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的顯著高表達(dá)，同時(shí)也表現(xiàn)出最高的APOE表達(dá)水平；另外，通過對(duì)六個(gè)細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，A4亞群存在獨(dú)立于其他亞群的轉(zhuǎn)錄組特征，是一種全新的細(xì)胞亞型，研究者將其命名為LARA（圖5）。

圖5.載脂蛋白E介導(dǎo)脂質(zhì)積聚反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成

5、APOE是脂質(zhì)積累反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞形成所必需的

那么LARA與高表達(dá)的APOE之間存在什么聯(lián)系呢？研究者接下來檢測了野生型、APOE?/?小鼠海馬區(qū)的LARA相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)77個(gè)被檢基因中有65個(gè)基因在KA刺激后表現(xiàn)出顯著變化，而在這65個(gè)基因中，又有55個(gè)基因被KA刺激上調(diào)并被APOE敲除抑制，10個(gè)基因表現(xiàn)出相反的模式。這些數(shù)據(jù)表明，APOE是影響LARA相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，是LARA形成的必要條件（圖5g）。

6、脂質(zhì)積聚的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞與癲癇小鼠的癲癇活動(dòng)有關(guān)

接下來，研究者對(duì)LARA在顳葉性癲癇中的功能表型進(jìn)行了探究。發(fā)現(xiàn)與KA刺激的野生型小鼠相比，無論是APOE KO還是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除APOE均能改善顳葉性癲癇小鼠的癲癇發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。證明了APOE介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在促癲癇中發(fā)揮重要作用，同時(shí)由于LARA形成依賴于APOE，進(jìn)一步說明LARA具有促癲癇作用（圖6）。

圖6.脂質(zhì)積聚的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞與癲癇小鼠的癲癇活動(dòng)有關(guān)

7、脂質(zhì)積累的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過星形膠質(zhì)細(xì)胞A2AR促進(jìn)癲癇活動(dòng)

那么LARA是通過何種分子機(jī)制來調(diào)控、促進(jìn)癲癇病發(fā)病呢？研究者通過使用游離FAs處理野生型或APOE^?/?小鼠的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，在體外模擬LARA的形成。采用RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)FAs能夠顯著誘導(dǎo)腺苷2A受體（A_2AR）表達(dá)上調(diào)，并且這種上調(diào)能夠被APOE KO所阻斷，同時(shí)，這一結(jié)果在KA誘導(dǎo)的癲癇小鼠海馬區(qū)的免疫熒光分析結(jié)果中得到了進(jìn)一步證實(shí)。

接下來為了進(jìn)一步驗(yàn)證A_2AR在促癲癇中的作用，研究者構(gòu)建了AAV-A_2AR-shRNA-eGFP小鼠模型實(shí)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中 特異性敲低A_2AR，當(dāng)施加KA刺激后，與A_2AR敲低星形膠質(zhì)細(xì)胞相鄰的海馬區(qū)神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)傳遞顯著降低，從而顯著降低了KA誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作活性。

另外，研究者通過外源施加A_2AR拮抗劑ZM241385抑制A_2AR的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制A_2AR的表達(dá)確實(shí)能夠顯著降低癲癇發(fā)作活性。這些結(jié)果表明，腺苷2A受體（A_2AR）在LARA介導(dǎo)的神經(jīng)毒性中發(fā)揮著核心作用。

圖7.脂質(zhì)積累反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過A2AR促進(jìn)癲癇小鼠的癲癇活動(dòng)

本研究發(fā)現(xiàn)，在顳葉癲癇（TLE）患者和癲癇小鼠模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞過度的脂質(zhì)積聚會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)積聚反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（LARA）的形成，LARA會(huì)促進(jìn)神經(jīng)元過度活躍并加速癲癇病的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)揭示了LARA的形成主要依賴于APOE的高表達(dá)，敲除APOE基因能夠有效抑制癲癇小鼠LARA的形成和癲癇發(fā)作活性。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了一種全新的星形膠質(zhì)細(xì)胞--LARA，并深入揭示了LARA促進(jìn)癲癇疾病發(fā)展進(jìn)程的分子機(jī)制，豐富了人們對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞病理功能的理解，為靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞治療藥物難治性癲癇奠定了理論基礎(chǔ)。