自噬與脂滴（LDs）作用及關系介紹：

自噬是一種依賴于溶酶體的細胞降解途徑，通過選擇性自噬消除受損或不需要的細胞器和有害的蛋白質(zhì)聚集物，控制細胞器質(zhì)量和數(shù)量，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、代謝和命運的調(diào)控，維持細胞穩(wěn)態(tài)。脂滴（lipid droplets,LDs）是細胞內(nèi)獨特的以中性脂質(zhì)填充、單層磷脂包圍的細胞器，是一種高度動態(tài)的結構，循環(huán)“形成—降解”這一過程。LDs除了通過脂解的作用，將脂滴內(nèi)的甘油三酯（TG）降解為甘油和脂肪酸，還可以依賴自噬-溶酶體的脂滴降解途徑。

細胞器選擇性自噬（selective autophagy）發(fā)生的關鍵步驟是自噬膜對損傷或不需要的細胞器的特異性識別和包裹，這一過程是通過自噬體上的LC3/GABARAP蛋白直接與特定的細胞器受體相互作用，或與細胞器相關的連接蛋白結合實現(xiàn)自噬的識別。到目前為止，許多這樣的受體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)指導線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和核糖體的包封。然而，特異性介導LDs識別和包過的蛋白質(zhì)仍有待確定。

研究小鼠模型發(fā)現(xiàn)：吞脂受體ORP8在細胞脂質(zhì)代謝中起著關鍵作用

2022年12月，浙江大學國際醫(yī)學院/附屬第四醫(yī)院的劉偉課題組與Dante Neculai課題組合作，在Protein & Cell雜志在線發(fā)表題為“ORP8 acts as a lipophagy receptor to mediate lipid droplet turnover”的研究論文，該研究采用集萃藥康Osbpl8-KO（B6/JGpt-Osbpl8em10Cd/Gpt）小鼠和B6-ob（B6/JGpt-Lepem1Cd25/Gpt）小鼠，報道了脂質(zhì)轉運體蛋白ORP8能定位脂滴，并通過LC3/GABARAP直接相互作用實現(xiàn)，招募自噬隔離膜對脂滴的包裹和經(jīng)由溶酶體的降解。ORP8被AMPK磷酸化，從而增強其對LC3的結合，促進LDs自噬。通過體內(nèi)外等等實驗結果表明ORP8是一種吞脂受體，在細胞脂質(zhì)代謝中起著關鍵作用。

1.ORP8的跨膜結構域是決定其脂滴定位的關鍵結構域

作者通過從細胞中分離LDs，后與純化的GST-LC3B孵育進行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)ORP8與LC3B存在相互作用，并通過細胞生化手段驗證了這一結論。同時作者通過Ariyscan高分辨率顯微成像、脂滴純化和APEX標記電鏡等手段確認了ORP8定位于LDs上，并在誘導噬脂的條件下定位增加。通過構建不同的ORP8突變體，作者進一步發(fā)現(xiàn)ORP8的跨膜結構域是決定其脂滴定位的關鍵結構域。

圖1.ORP8在LDs上的定位

2.ORP8突變體促進脂滴LDs降解

作者通過對細胞中ORP8基因的敲低和敲除發(fā)現(xiàn)，LDs和甘油三酯的含量發(fā)生上調(diào)。而通過過表達ORP8發(fā)現(xiàn)，顯著降低了細胞內(nèi)LDs含量和顯著降低了細胞內(nèi)TG水平。這些結果表明ORP8負向調(diào)節(jié)LDs代謝。

通過阻斷LDs的生物發(fā)生，分析ORP8-KO細胞中LDs的消耗發(fā)現(xiàn)，脂滴標志蛋白PLIN2表達未發(fā)生明顯變化。脂酰甘油三酯脂肪酶(aditriglyceride lipase, ATGL)作為LDs上的限速脂肪酶，其KO可增加細胞內(nèi)PLIN2和TG的水平；ATGL和ORP8的雙重KO可進一步增加PLIN2和TG的積累。這些結果表明，ORP8能促進LDs的降解，而不依賴于脂肪分解。這些結果表明，ORP8能促進LDs的降解，而不依賴于脂肪分解。

ORP8和ORP5是著名的脂質(zhì)轉運蛋白，它們將磷酸絲氨酸(PS)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉運到質(zhì)膜，將磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P)從質(zhì)膜轉運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。通過ORP8突變體ORP8-h514a /H515A與WT比較，過表達GFP-2A-ORP8-H514A/H515A顯著降低了細胞中的LDs。這些數(shù)據(jù)表明，ORP8參與LDs降解可能與其脂質(zhì)轉運活性無關。

圖2.ORP8促進LDs的周轉

3.ORP8直接參與脂滴自噬過程

作者發(fā)現(xiàn)ORP8促進脂滴降解依賴自噬蛋白ATG7；隨后利用構建的mCherry-GFP-livedrop探針來檢測細胞內(nèi)噬脂通量，同時通過共聚焦顯微成像與流式細胞術等手段，發(fā)現(xiàn)ORP8敲除細胞中脂滴自噬水平顯著降低；此外，ORP8與自噬體和溶酶體發(fā)生明顯的共定位；敲除ATG7或使用氯喹抑制自噬后，ORP8蛋白累積。這些觀察結果提示ORP8直接參與脂滴自噬過程，并且其自身經(jīng)自噬途徑降解。

圖3.噬脂作用需要ORP8

4.推測ORP8是介導脂滴自噬的受體蛋白實驗數(shù)據(jù)

根據(jù)先前研究結果，作者推測ORP8是介導脂滴自噬的受體蛋白。為了證實這一推測，作者通過脂滴純化、體外脂滴膜結合試驗、GST-pull down、CO-IP等實驗證明ORP8與LC3/GABARAP之間直接結合，而后發(fā)生相互作用。

圖4.ORP8-LC3相互作用的表征

5.AMPK磷酸化并激活ORP8實驗數(shù)據(jù)

先前的研究表明AMPK參與了噬脂，為了證明AMPK與ORP8之間的關系，作者通過誘導細胞脂滴自噬，發(fā)現(xiàn)能同時激活AMPK和導致ORP8的磷酸化，而抑制AMPK活性后ORP8的磷酸化水平被顯著減弱。

通過體外激酶實驗結合蛋白質(zhì)磷酸化修飾的質(zhì)譜分析，證實ORP8是AMPK的直接底物，同時證實了ORP8上的AMPK磷酸化位點Thr54和Ser65。此外，實驗發(fā)現(xiàn)AMPK對ORP8的磷酸化作用雖然不會增加ORP8在脂滴的定位，但能顯著增強ORP8與LC3的結合，從而促進脂滴自噬。這些結果表明AMPK通過直接磷酸化ORP8來促進ORP8與LC3/GABARAP的相互作用，從而激活ORP8介導的噬脂作用。

圖5.AMPK在脂吞噬過程中調(diào)節(jié)ORP8的活性

6.ORP8可減少小鼠肝臟脂質(zhì)沉積

作者通過研究過表達ORP8的ob/ob肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中的脂滴和甘油三酯的含量升高速率減緩；通過對Osbpl8-KO與WT小鼠肝臟中脂滴含量對比，發(fā)現(xiàn)Osbpl8-KO小鼠肝臟中脂滴含量增高，并且在禁食后尤為明顯的脂滴累積表型。表明ORP8在體內(nèi)LDs分解代謝中起著重要作用。

圖6.ORP8可減輕小鼠的脂質(zhì)沉積

實驗結論

在本研究中，通過體外和體內(nèi)分析，明確了ORP8是介導脂滴自噬的特異受體。實驗結果表明，ORP8通過AMPK調(diào)節(jié)的與LC3/GABARAPs的相互作用介導自噬識別和降解LDs。這些發(fā)現(xiàn)可能為脂代謝相關疾病的干預和治療提供新的靶點。