2022年10月3日，廈門大學(xué)吳喬教授團(tuán)隊(duì)在Nature Metabolism在線發(fā)表了題為“HK1 from hepatic stellate cell–derived extracellular vesicles promotes progression of hepatocellular carcinoma”的文章。該研究使用來自集萃藥康的Hk1f/f（品系編號(hào)：T052189）和Lrat-P2A-iCre（品系編號(hào)：T006205）小鼠模型進(jìn)行研究，結(jié)合免疫熒光技術(shù)、GST pull-down實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析等多個(gè)技術(shù)手段，揭示了肝星狀細(xì)胞中HK1通過胞外囊泡釋放后能夠加速肝癌進(jìn)程的機(jī)制。同時(shí)篩選到一種抑制HCC進(jìn)展的化合物PDNPA，為HCC的治療提供一種新策略。

1、TGF-β促纖維化過程中誘導(dǎo)HSCs分泌lEV HK1

為了研究纖維化過程中細(xì)胞間交流，研究者在LX-2肝星狀細(xì)胞中分別提取了胞外大囊泡和胞外小囊泡，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)HK1是TGF-β刺激后胞外大囊泡中最為富集的蛋白之一。TGF-β能夠促進(jìn)小鼠肝星狀細(xì)胞通過胞外大囊泡分泌HK1。研究者利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)纖維化伴隨著胞外大囊泡外泌HK1。共聚焦結(jié)果顯示，TGF-β處理促進(jìn)了HK1從線粒體向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移。此外，過量表達(dá)TSG101顯著增加了胞外大囊泡中HK1的分泌。表明HK1是通過胞外大囊泡從肝星狀細(xì)胞特異性分泌的，TGF-β誘導(dǎo)線粒體HK1運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，而TSG101進(jìn)一步協(xié)助HK1通過胞外大囊泡分泌。

圖1.TGF-β誘導(dǎo)肝纖維化中l(wèi)EV HK1的分泌

2、HK1的棕櫚?；龠M(jìn)了HK1靶向質(zhì)膜的分泌

研究者發(fā)現(xiàn)用去棕櫚?；敢种苿┳貦耙炙谺（PalmB）或TGF-β處理能夠顯著增強(qiáng)HK1棕櫚酰化程度，而用棕櫚?；种苿?-溴棕櫚酸酯（2-BP）處理，則去除了HK1的棕櫚酰化。此外，即使用TGF-β處理，HK1在質(zhì)膜上的定位仍會(huì)被2-BP阻斷，而當(dāng)沒有TGF-β處理時(shí)，會(huì)被PalmB增強(qiáng)。表明TGF-β誘導(dǎo)的棕櫚酰化有利于HK1從線粒體轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，然后通過胞外大囊泡分泌。敲除去棕櫚?；窤BHD17B能夠明顯增強(qiáng)HK1的棕櫚?；头置?，并且影響了TGF-β對(duì)HK1的誘導(dǎo)。因此，在肝纖維化過程中，TGF-β通過抑制ABHD17B依賴的HK1的去棕櫚?；瘉泶龠M(jìn)HK1的分泌。

圖2.TGF-β誘導(dǎo)HK1棕櫚?；⑾蛸|(zhì)膜運(yùn)輸

3、HCC細(xì)胞劫持來源于肝星狀細(xì)胞的lEV HK1以加速糖酵解過程

研究者對(duì)CCLE進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞表達(dá)的HK1水平相對(duì)較低。此外，通過共聚焦觀察及對(duì)肝癌相關(guān)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞中的HK1蛋白可能不是自身表達(dá)的，而是來源于對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌的lEV HK1的攝取。鑒于HK1在糖酵解中的重要作用，作者研究發(fā)現(xiàn)Huh7和HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收和胞外酸化率（ECAR）明顯升高的現(xiàn)象在HK1敲除的情況下沒有發(fā)生。當(dāng)重新表達(dá)HK1時(shí)，可以提高Huh7和HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量、ECAR的能力以及細(xì)胞增殖情況。此外，用糖酵解抑制劑處理Huh7和HepG2細(xì)胞時(shí)，lEVs不再促進(jìn)細(xì)胞增殖。表明肝星狀細(xì)胞釋放的HK1通過糖酵解重編程促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖。

圖3.HCC細(xì)胞劫持來源于肝星狀細(xì)胞的lEV HK1以促進(jìn)糖酵解

4、HSC衍生的lEV HK1促進(jìn)小鼠模型中的HCC進(jìn)展

為了進(jìn)一步探索lEV HK1與HCC之間的關(guān)系，作者對(duì)小鼠肝癌模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)lEV HK1顯著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并且伴隨著Ki67的蛋白水平升高。通過對(duì)Hk1f/f與Gfap-Cre的小鼠進(jìn)行雜交，得到在肝星狀細(xì)胞中 特異性敲除Hk1的小鼠（Hk1f/f；Gfap-Cre），其腫瘤生長(zhǎng)及HK1和Ki67表達(dá)受到抑制。此外，研究者發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞來源的HK1能明顯促進(jìn)肝癌的肺部轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移組織中的HK1表達(dá)升高，表明lEV HK1能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

圖4.不同條件誘導(dǎo)的小鼠模型證明了lEV HK1在促進(jìn)HCC進(jìn)展中的作用

5、Nur77抑制HSC分泌lEV HK1以抑制肝癌的發(fā)展進(jìn)程

據(jù)報(bào)道，孤核受體Nur77可抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化。研究者通過將Nur77轉(zhuǎn)染到LX-2細(xì)胞中證實(shí)了這一點(diǎn)。Nur77能夠上調(diào)ABHD17B表達(dá)，敲除Nur77或敲除ABHD17B后，lEV HK1的分泌增多且棕櫚?；鰪?qiáng)。表明Nur77抑制lEV HK1棕櫚?；宰璧K HK1的分泌。研究者利用不同蛋白激酶的抑制劑處理LX-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt途徑的抑制劑LY294002能阻斷TGF-β誘導(dǎo)的Nur77的降解。此外，當(dāng)HK1在肝星狀細(xì)胞中被特異性敲除時(shí)，Nur77的缺失不再影響腫瘤生長(zhǎng)。表明Nur77通過抑制肝星狀細(xì)胞分泌lEV HK1，從而抑制肝癌的發(fā)展進(jìn)程。

圖5.Nur77抑制HSC分泌lEV HK1

6、小分子PDNPA靶向Nur77以抑制lEV HK1的分泌

研究者通過篩選發(fā)現(xiàn)小分子化合物PDNPA能與Nur77配體結(jié)合域結(jié)合，由此阻礙了Akt與Nur77的相互作用，并且顯著修復(fù)TGF-β降低的Nur77蛋白水平，抑制HK1的外泌。此外PDNPA在基因和蛋白水平上恢復(fù)了ABHD17B的表達(dá)，從而阻止了TGF-β誘導(dǎo)的HK1棕櫚酰化和分泌。在小鼠肝細(xì)胞癌模型中，PDNPA能夠顯著減少腫瘤數(shù)目及腫瘤組織中HK1和Ki67的表達(dá)。在肝星狀細(xì)胞中 特異性刪除Nur77后，PDNPA作用被削弱。因此，PDNPA誘導(dǎo)的Nur77表達(dá)的升高通過抑制肝星狀細(xì)胞分泌lEV HK1從而抑制肝癌的發(fā)展進(jìn)程。

圖6.PDNPA誘導(dǎo)Nur77的表達(dá)以抑制lEV HK1的分泌

結(jié)論

上述研究表明，在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞中TGF-β能通過PI3K-Akt途徑誘導(dǎo)Nur77降解，導(dǎo)致ABHD17B的表達(dá)受到抑制，因此增強(qiáng)了HK1的棕櫚酰化，促進(jìn)HK1轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜并通過lEVs分泌。而肝星狀細(xì)胞來源的lEV HK1能夠被HCC細(xì)胞劫持來促進(jìn)糖酵解重編程和肝癌的發(fā)展進(jìn)程。此外，研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物PDNPA靶向Nur77以抑制TGF-β誘導(dǎo)的HK1分泌，從而有效延緩肝癌發(fā)病。

補(bǔ)充知識(shí)：

肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSCs）主要參與肝臟纖維化，并且與肝細(xì)胞癌（HCC）關(guān)系密切[1-2]。大多數(shù)HCC病例是在嚴(yán)重的肝臟纖維化或肝硬化的情況下發(fā)生的。促纖維化細(xì)胞因子TGF-β在發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)過程中調(diào)節(jié)著各種過程，在纖維化的肝臟中明顯增加以激活肝星狀細(xì)胞[3]。臨床數(shù)據(jù)顯示，活化的肝星狀細(xì)胞與HCC患者的預(yù)后不佳有關(guān)，并以多種方式影響HCC的發(fā)展[4-5]。胞外囊泡（EVs）在腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞間交流中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可作為早期HCC診斷的生物標(biāo)志物[6-7]。研究EV介導(dǎo)的HCC細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞之間的相互作用有望進(jìn)一步促進(jìn)臨床治療。糖酵解重編程也是肝臟纖維化的一個(gè)重要特征[8]。Hexokinase（HK）是糖酵解的重要限速酶之一，對(duì)葡萄糖的利用至關(guān)重要。最近，HK1被認(rèn)為可以促進(jìn)腫瘤的代謝重編程[9]，然而HK1在HCC進(jìn)展中的功能尚不明確。

參考文獻(xiàn)

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