銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）感染仍然是全球公共衛(wèi)生的主要威脅，需要新的安全有效的疫苗來(lái)預(yù)防由銅綠假單胞菌引起的感染。銅綠假單胞菌PAO1(P. aeruginosa PAO1)是一種廣泛用于制備疫苗的實(shí)驗(yàn)室菌株，X射線滅活的PAO1(XPa)上清液中發(fā)現(xiàn)了核酸和8-羥基鳥(niǎo)苷(8-OHG)。XPa在體外刺激了DCs(dentritic cell)中的cGAS-STING通路和Toll樣受體，DC最終發(fā)生了凋亡和細(xì)胞焦亡。在體外，由XPa刺激的DC誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖并在體內(nèi)產(chǎn)生免疫記憶。XPa保護(hù)肺炎模型中的小鼠免受PAO1或耐多藥臨床分離株W9的感染。

2021年10月，四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療與癌癥中心國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王震玲團(tuán)隊(duì)在Signal Transduction and Targeted Therapy發(fā)表了題為“A novel inactivated whole-cell Pseudomonas aeruginosa vaccine that acts through the cGAS-STING pathway”的文章。該研究采用集萃藥康Tlr4-KO（B6/JGpt-Tlr4em26Cd1829/Gpt）小鼠，報(bào)道了一種抗銅綠假單胞菌感染的X射線滅活全細(xì)胞疫苗的新機(jī)制。

正文

1、X射線輻照誘導(dǎo)PAO1核酸釋放

團(tuán)隊(duì)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察了X射線照射后PAO1的形狀。PAO1細(xì)胞顯示出一致的密度，DNA分子和電子光物質(zhì)幾乎隨機(jī)分布在細(xì)胞的所有部位。同時(shí)測(cè)試了XPa和PAO1上清液中核酸和8-OHG的濃度，核酸濃度從25.4±0.5ng/μL顯著增加至319.4±3.6ng/μL(約13倍)。8-OHG的濃度從50.02 ± 0.63 ng/mL顯著增加至261.90 ± 35.18 ng/mL(約5倍)。表明細(xì)胞中的核酸被X射線照射破壞并釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。

圖1. XPa的形態(tài)和生化特征

2、XPa調(diào)節(jié)DC功能

在XPa刺激后評(píng)估了骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)的功能。DCs在XPa刺激后顯著上調(diào)CD86、CD80和MHCII表達(dá)。成熟的DCs表現(xiàn)出下調(diào)的吞噬能力，DC將處理過(guò)的抗原呈遞給T細(xì)胞，并在抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)期間引發(fā)T細(xì)胞增殖。

圖2. XPa對(duì)DC功能的影響

3、XPa激活DCs中的STING

通過(guò)XPa刺激的BMDCs中的免疫熒光染色觀察了STING的運(yùn)動(dòng)。與XPa一起孵育的 DC顯示出細(xì)胞形態(tài)的改變（形成偽足），通過(guò)慢病毒感染構(gòu)建了293T-STING-GFP細(xì)胞，并用XPa刺激細(xì)胞3h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核周?chē)心鄣木G色熒光。在293T-STING-GFP中，STING 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。為了證實(shí)STING途徑的激活，將IFN-β啟動(dòng)子-熒光素酶(Luc)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T-STING-GFP中，293T-STING-GFP-Luc細(xì)胞在受到 cGAMP(STING激動(dòng)劑)刺激時(shí)產(chǎn)生高熒光素酶強(qiáng)度(160.5±3.54)，在XPa刺激時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)度為63.5±2.12，約為cGAMP的40%。表明XPa激活了cGAS-STING途徑。

圖3. XPa激活BMDCs中的STING

4、XPa激活cGAS-STING通路

由于全細(xì)胞疫苗含有多種抗原，XPa的作用機(jī)制涉及復(fù)雜的通路，包括MyD88非依賴(lài)性途徑(cGAS-STING)和MyD88依賴(lài)性途徑(TLRs)。研究中，Pepinh-MyD(MyD88抑制劑)和sicgas(cgas的siRNA)用于分析XPa激活的BMDCs中TLR和cGAS-STING途徑的影響，表明DCs對(duì)XPa的反應(yīng)主要取決于cGAS-STING和TLR，并且cGAS-STING占主導(dǎo)地位。

圖4. XPa刺激的DCs中激活的通路以及免疫和感染過(guò)程中的免疫反應(yīng)

5、DCs凋亡和焦亡

研究中，XPa刺激后BMDCs經(jīng)歷了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡。Caspase 3為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，Caspase 11為細(xì)胞焦亡的標(biāo)志物，在XPa刺激后，Caspase 3在幾乎所有的DCs 中都有表達(dá)，但只有少數(shù)DCs表達(dá)Caspase 11。表明細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡共同調(diào)節(jié)XPa 引發(fā)的免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡是主要結(jié)果。

圖5. XPa體外免疫后DCs的發(fā)展

6、XPa誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞

為了探索T細(xì)胞類(lèi)型對(duì)疫苗免疫反應(yīng)的變化，團(tuán)隊(duì)在一次XPa免疫后兩周收集了小鼠的血液、左腹股溝淋巴結(jié)和脾臟，測(cè)試了CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞比例， CD8+T細(xì)胞在淋巴結(jié)和脾臟中增加，血液中沒(méi)有增加。XPa免疫兩周后，淋巴結(jié)中的CD8+TEM減少，但CD4+T細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有變化。CD4+ TCMs在淋巴結(jié)中的比例增加，而在血液和脾臟中保持不變。

圖6. 體內(nèi)T細(xì)胞和炎癥因子

7、XPa保護(hù)肺炎模型中的小鼠免受PAO1或W9的感染

XPa在由PAO1引起的急性細(xì)菌性肺炎小鼠模型中表現(xiàn)出積極的保護(hù)作用。在用PAO1感染后，WT小鼠在第2天全部死亡，XPa處理的動(dòng)物體重沒(méi)有觀察到差異。

圖7. 疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)作用

結(jié)論

文章研究了一種名為XPa針對(duì)銅綠假單胞菌的滅活全細(xì)胞疫苗。XPa在由PAO1或W9誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型中顯示出良好的保護(hù)作用。比較了cGAS-STING和TLRs通路，發(fā)現(xiàn)了一種針對(duì)銅綠假單胞菌感染的輻照滅活全細(xì)胞疫苗的新機(jī)制。

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