尾靜脈注射作為實驗動物給藥的常規(guī)方法，其操作細節(jié)已廣為人知。然而，當我們深入探究其內(nèi)在機制，特別是將注射對象替換為質粒DNA，一種更為精妙的基因遞送技術——流體動力學注射（Hydrodynamic injection）便展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。今天小編將系統(tǒng)闡述該技術的核心原理、操作關鍵、影響因素、應用場景及其安全性，為研究者提供深入理解和優(yōu)化這一方法的參考。

定義與核心特征

流體動力學注射本質上是一種通過小鼠尾靜脈，在極短時間內(nèi)（5-8秒）快速注入大體積（相當于小鼠體重8%～10%）質粒DNA溶液的基因遞送技術。該方法的建立可追溯至1999年Liu等科學家的開創(chuàng)性工作^[1]。他們發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的局部注射（如肌肉注射[2]）相比，這種大容積、高速率的靜脈注射方式能顯著提升小鼠體內(nèi)轉基因的表達水平，尤其在肝臟組織中。這一質粒遞送系統(tǒng)因其特點鮮明，常被視為病毒遞送系統(tǒng)的有效替代或補充。質粒系統(tǒng)轉染效率相對較低且表達時間較短，但制備過程簡單快捷、成本低廉，且避免了引發(fā)免疫反應的風險，安全性較高。相比之下，病毒系統(tǒng)雖感染效率高、表達持久，但制作純化復雜昂貴，并存在免疫原性等潛在安全性問題。

作用原理：壓力驅動的肝細胞遞送

流體動力學注射的核心機制在于其產(chǎn)生的瞬時流體力學效應。將如此龐大的液體體積在數(shù)秒內(nèi)注入靜脈循環(huán)系統(tǒng)，會造成一系列連鎖反應。首先，這導致心臟瞬時負荷過重。隨之，大量含有質粒DNA的溶液主要淤積在肝臟血管床內(nèi)，引起肝臟內(nèi)部的壓力急劇升高。這種高壓環(huán)境迫使肝竇內(nèi)皮細胞間的窗孔結構擴大，同時導致肝細胞膜出現(xiàn)暫時性的微小孔隙。質粒DNA分子正是通過這些物理性形成的通道，得以高效地進入肝細胞內(nèi)部，進而啟動目的基因的表達過程^[3]。

圖1：流體動力學注射質粒的作用原理

操作流程與關鍵參數(shù)

操作層面，流體動力學注射延續(xù)了標準尾靜脈注射的基本步驟（攻克小鼠尾靜脈注射！3步精講，小白變高手）：包括小鼠的妥善固定、尾靜脈的有效擴張以及最終的注射環(huán)節(jié)。一般尾靜脈注射體積為0.05-0.1ml/10g，推注速度約為0.05-0.1ml/s，以減少小鼠應激為主。 其區(qū)別于常規(guī)注射的核心在于兩個硬性參數(shù)：注射體積必須精確控制在小鼠體重的8%～10%之間，且整個注射過程需在5-8秒內(nèi)迅速完成。這兩個參數(shù)是實現(xiàn)高效基因表達的基礎保障。

影響基因表達效率的關鍵因素

實現(xiàn)高效的體內(nèi)基因表達并非易事，多個關鍵因素需協(xié)同考慮：

質粒構象的決定性影響： 質粒DNA的物理形態(tài)對其表達效能影響顯著。Chen ZY等人（2001）^[4]的研究揭示了一個重要規(guī)律：線性DNA（LDNA）相較于環(huán)狀DNA（CDNA），在介導目的基因表達上展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，表達量可提高10至100倍，且表達時間可持續(xù)長達9個月。更為優(yōu)化的是，若進一步去除線性DNA中的細菌骨架序列（LFDNA），不僅能進一步延長和增強轉基因表達，還能顯著降低機體炎癥因子的產(chǎn)生，減輕免疫反應（圖2）。

圖2：左圖為不同形式DNA介導的hFIX在小鼠體內(nèi)的表達水平；右圖為不同形式DNA在小鼠體內(nèi)誘導的炎癥因子水平。

注射液類型的選擇： 溶解質粒DNA的溶液類型對表達效率和肝臟健康至關重要。Feng D等人（2004）^[5]的細致研究表明，使用Ringer液溶解質?？色@得最高的基因表達水平，同時其對肝臟的毒性也是最小的。研究者推測這得益于Ringer液中的CaCl?成分，可能促進了DNA的細胞內(nèi)化過程。相比之下，使用PBS或生理鹽水作為溶劑時，表達水平較低且對肝臟的損傷更大（表現(xiàn)為血清ALT升高，圖3）。值得注意的是，在生理鹽水中加入聚乙二醇（PEG） 被證明有助于穩(wěn)定進入肝細胞的質粒DNA，并提升其向細胞核轉運的效率。

圖3. 不同注射液流體動力學注射質粒8小時后，血液ALT水平（左圖）及hFIX表達情況（右圖）

體積配比的精確控制： 快速注射產(chǎn)生的大幅液體壓力不僅允許外源質粒高效進入肝細胞，也會使部分質粒進入腎臟、脾臟、肺和心臟等其他組織，從而實現(xiàn)多器官轉基因表達。由于肝臟獨特的血液供應和內(nèi)皮結構特性，其轉基因表達水平顯著高于其他器官，整體仍以肝臟為主導。注射液體積與小鼠體重的比例是調控基因表達組織分布和效率的關鍵參數(shù)。針對不同體重范圍小鼠（如11-13g、18-20g、30-33g）的研究一致表明，當注射體積達到小鼠體重8%-10%的黃金比例時，轉基因在肝臟、腎臟、脾臟、肺和心臟等主要器官中的表達效果達到最優(yōu)狀態(tài)。

注射速度的嚴格把握： 完成注射的時間窗口是另一個不容忽視的關鍵點。轉基因表達的最佳效果要求注射在5-8秒內(nèi)一氣呵成（圖4）。一旦注射時間拖延超過15秒，表達水平將急劇衰減甚至無法檢測。然而，需要警惕的是，追求速度（尤其在大體積注射時）會加劇注射后肝臟的瞬時損傷程度。因此，在確保注射效率的前提下，精細控制注射速度以平衡表達效率與動物福利至關重要。

圖4：不同注射時間對質粒在各組織表達水平的影響。

動物狀態(tài)的細微作用： 實驗動物的生理狀態(tài)也能微妙地影響注射效果。研究表明，在麻醉狀態(tài)下進行流體動力學注射有助于提升轉基因表達。這可能是由于麻醉降低了心率和心輸出量，使得快速注入的DNA溶液能更有效地逆流至肝臟，而并未額外增加肝臟毒性。此外，動物的性別（雌性可能高于雄性） 和品系（如ICR品系可能高于B6品系） 也可能在某種程度上影響表達水平，值得在實驗設計中關注。

表達峰值的捕捉

成功注射后，轉基因表達通常在8-24小時左右達到峰值，之后便迅速下降。這種快速衰減與質粒DNA進入肝臟后的動力學有關：最初的1-3天內(nèi)表達會急劇丟失，隨后的4-7天則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。因此，研究者必須根據(jù)具體實驗目標（如研究急性效應還是短期表達），精確選擇檢測的時間窗口，以捕捉到目標表達水平。

應用領域的廣泛拓展

流體動力學注射技術的應用范圍早已超越了最初的質粒DNA遞送。它已被證明能成功地將RNA分子、蛋白質甚至病毒載體等多種類型的大分子物質高效遞送到動物體內(nèi)。這種靈活性使其在多個研究領域大放異彩：它成為基因功能體內(nèi)快速驗證的有力工具^[6]，被探索用于肝臟靶向性基因治療的研究策略^[7]，并且特別在構建肝癌模型方面展現(xiàn)了巨大價值，為癌癥機制研究和治療開發(fā)提供了重要平臺^{[8, 9]}。

安全性的審慎評估

總體而言，流體動力學注射被認為是一種相對安全的基因遞送方法。注射后，小鼠因液體負荷體重會短暫快速增加，但通常在4-10小時內(nèi)即可恢復正常。臨床生化指標監(jiān)測顯示，血液中Na?、K?、Cl?及總蛋白濃度基本維持在生理范圍內(nèi)。雖然作為肝損傷標志物的血清ALT水平在注射后會短暫性升高，但這種升高通常與注射的質粒本身或表達的基因產(chǎn)物無關，并在3天后基本恢復正常。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，約5%的肝細胞在注射后會呈現(xiàn)可逆性損傷，伴有局部出血和壞死灶；到注射后4天左右，肝臟內(nèi)出現(xiàn)單核細胞聚集增生，標志著修復過程的啟動，肝臟結構功能逐步恢復。尤為重要的是，質粒DNA進入肝細胞后主要以游離體（episome）的形式存在，不會整合到宿主染色體中，從根本上消除了干擾內(nèi)源基因或引發(fā)插入突變的風險。

展望：挑戰(zhàn)與未來方向

流體動力學注射憑借其操作相對簡便、成本效益高、安全性可控（低免疫原性、無基因組整合風險）以及在肝臟實現(xiàn)高效瞬時表達的獨特優(yōu)勢，已成為基礎研究領域不可或缺的基因遞送工具。隨著后基因組時代對基因功能深入解析的需求日益增長，安全高效的體內(nèi)遞送技術顯得尤為重要，非病毒載體系統(tǒng)在此展現(xiàn)出獨特的應用潛力。盡管目前該技術在實驗動物模型（尤其是小鼠）中已相當成熟，并發(fā)展出導管輔助等改進方法，但將其轉化應用于臨床人體治療仍面臨重大挑戰(zhàn)，其中最大的障礙在于人體對超大體積快速靜脈注射的耐受性問題。

未來的研究焦點應集中在克服現(xiàn)有局限上：開發(fā)更精準的組織靶向策略以降低所需體積、探索減輕瞬時高壓對器官（尤其是心血管和肝臟）損傷的方法、以及設計新型載體系統(tǒng)以延長轉基因的穩(wěn)定表達時間。通過持續(xù)深入的技術創(chuàng)新和機制研究，流體動力學注射技術有望迎來突破性進展，最終發(fā)展成為更安全、便捷、高效的基因治療遞送平臺和功能研究利器。

參考文獻

[1] Liu F, et al. Gene Ther 1999, 6:1258

[2] Wolff JA, et al. Science 1990, 247:1465

[3] Kamimura K, et al. Pharmaceutics 2015, 7:213

[4] Chen ZY, et al. Mol Ther 2001, 3:403

[5] Feng DM, et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 2004, 31:850

[6] Kawano F, et al. Nat Chem Biol 2016, 12:1059

[7] Arad U, et al. Hum Gene Ther 2005, 16:361

[8] Chen X, et al. Am J Pathol 2014, 184:912

[9] Xue W, et al. Nature 2014, 514:380