雙特異性T細(xì)胞銜接器（T-Cell Engager，TCE）是一類創(chuàng)新性雙特異性抗體藥物，能夠同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原和T細(xì)胞表面CD3受體，通過(guò)重定向T細(xì)胞特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤治療效果。體外篩選是TCE藥物開發(fā)流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在從大量候選分子中高效識(shí)別出具有高活性、低毒性的先導(dǎo)化合物。TCE藥物的體外評(píng)價(jià)主要核心指標(biāo)：靶點(diǎn)結(jié)合親和力，腫瘤細(xì)胞特異性殺傷，T細(xì)胞激活與增值效應(yīng)以及細(xì)胞因子釋放特征等。

2024年5月，F(xiàn)DA加速批準(zhǔn)了靶向DLL3和CD3的雙特異性T細(xì)胞銜接器Tarlatamab用于治療廣泛期小細(xì)胞肺癌（ES-SCLC）成人患者。本文以Tarlatamab為例，系統(tǒng)展示其臨床前體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖1. TCE藥物的作用機(jī)制^[2]

案例研究一: DLL3腫瘤細(xì)胞系篩選與表面抗原定量分析

目的：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)8株小細(xì)胞肺癌（SCLC）細(xì)胞系的DLL3表面表達(dá)（陽(yáng)性率及抗原量），篩選適宜細(xì)胞模型，為后續(xù)活性評(píng)估提供依據(jù)。

結(jié)果：檢測(cè)顯示多數(shù)SCLC細(xì)胞系均表達(dá)DLL3，其中SHP-77細(xì)胞系的表達(dá)水平最高。

圖2. 8種小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系中DLL3蛋白表達(dá)水平

表1. 8種小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系表面DLL3表達(dá)水平

案例研究二: 細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)

目的：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估Tarlatamab與T細(xì)胞（Jurkat、PBMCs）CD3及SCLC細(xì)胞DLL3的結(jié)合特性。

結(jié)果：Tarlatamab對(duì)DLL3表現(xiàn)出高親和力結(jié)合，而對(duì)CD3的結(jié)合能力相對(duì)較弱 。

圖3. CD3（左）與DLL3（右）的細(xì)胞水平親和力分析

案例研究三: T細(xì)胞活化報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（NFAT-Luc Jurkat 細(xì)胞模型）

目的：將Jurkat-NFAT-Luc細(xì)胞與SHP-77共培養(yǎng)，經(jīng)Tarlatamab處理5小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶活性，評(píng)估T細(xì)胞活化程度。

結(jié)果：Tarlatamab在腫瘤共培養(yǎng)體系中可顯著激活NFAT信號(hào)通路。為 TCE 藥物活性評(píng)價(jià)提供了快速高效的篩選平臺(tái)。

圖4. NFAT-Luc Jurkat細(xì)胞激活的熒光素酶活性檢測(cè)

案例研究四: T細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（TDCC）

目的：利用原代PBMCs和腫瘤細(xì)胞，評(píng)估腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

方法1：基于流式細(xì)胞術(shù)的TDCC實(shí)驗(yàn)

將PBMCs與CFSE標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞按5:1的效靶比共培養(yǎng)48小時(shí)，SYTOX-AAD染色后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量腫瘤細(xì)胞殺傷率。

結(jié)果：Tarlatamab可有效介導(dǎo)PBMCs殺傷SCLC細(xì)胞系，包括DLL3低表達(dá)細(xì)胞系，且細(xì)胞毒性與作用時(shí)間呈正相關(guān)。

圖5. AMG 757針對(duì)典型SCLC細(xì)胞系的時(shí)間-劑量效應(yīng)曲線

方法2: 基于熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞系的活性檢測(cè)

目的：將PBMCs與表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞按5:1的效靶比共培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)發(fā)光值（RLU）并計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞殺傷率。

結(jié)果：Tarlatamab可顯著介導(dǎo)PBMCs殺傷NCI-H82-Luc細(xì)胞系，其細(xì)胞毒性與作用時(shí)間呈正相關(guān)。

圖6. Tarlatamab針對(duì)NCI-H82-Luc細(xì)胞系的時(shí)間-劑量效應(yīng)曲線

案例研究五: TDCC 中的細(xì)胞因子釋放分析

目的：采用流式細(xì)胞微球陣列（CBA）技術(shù)檢測(cè)TDCC上清液中細(xì)胞因子水平。

結(jié)果：在腫瘤細(xì)胞與PBMCs共培養(yǎng)體系中，Tarlatamab誘導(dǎo)了多種細(xì)胞因子呈劑量依賴性釋放，其中IFN-γ在48小時(shí)達(dá)到頂峰后逐漸下降。

圖7. 腫瘤細(xì)胞與PBMCs共培養(yǎng)體系中的劑量依賴性細(xì)胞因子釋放

案例研究六: TDCC中的T細(xì)胞活化分析

目的：通過(guò)檢測(cè)CD69、CD25、CD71、CD137、PD-1及PD-L1表達(dá)水平，評(píng)估T細(xì)胞活化狀態(tài)。

結(jié)果：Tarlatamab可顯著誘導(dǎo)CD4?和CD8?T細(xì)胞表達(dá)活化標(biāo)志物，同時(shí)上調(diào)PD-1/PD-L1表達(dá)，為聯(lián)合PD-1/PD-L1 抑制劑治療提供了理論依據(jù)。時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)顯示T細(xì)胞活化標(biāo)志物呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。

圖8. Tarlatamab處理后CD4+與CD8+T細(xì)胞的生物標(biāo)志物表達(dá)

案例研究七: T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

目的：評(píng)估Tarlatamab在不同DLL3表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對(duì) T細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果：Tarlatamab以DLL3依賴性方式顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖。

圖9. Tarlatamab促進(jìn)T細(xì)胞增殖

案例研究八: 旁觀者效應(yīng)評(píng)估

目的：評(píng)估Tarlatamab是否可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)鄰近DLL3陰性腫瘤細(xì)胞的清除。NCI-H446細(xì)胞經(jīng)工程化改造以表達(dá)熒光素酶，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶（Luc）分析對(duì)NCI-H446細(xì)胞的殺傷情況。 

結(jié)果：在SHP-77存在的情況下，Tarlatamab可誘導(dǎo)對(duì)NCI-H446細(xì)胞的殺傷，與劑量和共孵育時(shí)間呈正相關(guān)。這種效應(yīng)可能與T細(xì)胞活化增強(qiáng)或細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷作用相關(guān)。

圖10. Tarlatamab誘導(dǎo)抗原陰性腫瘤細(xì)胞的殺傷

集萃藥康（GemPharmatech）建立了完善的TCE藥物體外評(píng)價(jià)平臺(tái)，可系統(tǒng)開展抗原表達(dá)譜分析、結(jié)合親和力測(cè)定，免疫細(xì)胞激活及腫瘤細(xì)胞殺傷等全方位評(píng)估，為TCE候選藥物的篩選與優(yōu)化提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，提升臨床前研究成功率。