我們的日常生活中潛伏著各種各樣的病原體，為了守衛(wèi)機(jī)體的健康，獲得性免疫系統(tǒng)通過(guò)抗體多樣化過(guò)程產(chǎn)生數(shù)以億計(jì)的抗體分子，特異性地對(duì)抗入侵的病原體。

片段插入和缺失是低頻有害的基因組DNA突變，片段插入促進(jìn)互補(bǔ)決定區(qū)3（CDR3）的多樣化對(duì)于靶向病毒的廣泛中和和多反應(yīng)性抗體的抗原結(jié)合功能至關(guān)重要，這是免疫球蛋白多樣化的關(guān)鍵步驟。眾所周知，片段插入或缺失很難被發(fā)現(xiàn)，因此很難定義這一過(guò)程中涉及的機(jī)制，由于檢測(cè)這些低頻事件存在挑戰(zhàn)，在抗體多樣化過(guò)程中產(chǎn)生的片段插入或缺失的機(jī)制仍然知之甚少。

2023年3月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀團(tuán)隊(duì)在SCIENCE IMMUNOLOGY上發(fā)表了題為“DNA repair mechanisms that promote insertion-deletion events during immunoglobulin gene diversification”的文章。該研究采用集萃藥康小鼠T008150 Polb-flox(C57BL/6JGpt-Polbem1Cflox/Gpt)，揭示了±1bp和>1bp缺失或插入產(chǎn)生機(jī)制的差異。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)外切酶或聚合酶的遺傳學(xué)操作獲得了能夠增加抗體基因缺失或插入的小鼠模型，為廣譜中和抗體的篩選提供了新的思路和方法。

該研究的亮點(diǎn)是開(kāi)發(fā)了一種乘客抗體基因（Passenger-Ig）系統(tǒng)并結(jié)合超深度測(cè)序解決了前人無(wú)法檢測(cè)低頻片段缺失或插入的困難。乘客抗體基因系統(tǒng)可以這樣理解，出租車是B細(xì)胞，車內(nèi)有司機(jī)和乘客。司機(jī)是負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞生存的功能性等位基因，而乘客則是不負(fù)責(zé)編碼抗體的等位基因，只用觀察和體驗(yàn)車內(nèi)外的環(huán)境，因此可以不受外界干擾，真實(shí)記錄所有發(fā)生的事件。

DNA片段缺失或插入是基因組中單個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失或插入，在免疫球蛋白即抗體的基因可變區(qū)外顯子中，片段缺失或插入(<50 bp)通常會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞受體編碼錯(cuò)誤。罕見(jiàn)抗病毒廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibody, bnAbs)獲得廣譜中和能力關(guān)鍵在于長(zhǎng)片段缺失或插入。例如，抗體與HIV包膜三聚體表位的結(jié)合力可以通過(guò)抗HIV廣譜中和抗體基因上的片段插入的途徑來(lái)提高。本研究利用一種抗體無(wú)功能等位基因系統(tǒng)，同時(shí)結(jié)合超深度測(cè)序克服了片段缺失或插入檢測(cè)的困難，成功捕捉到生理?xiàng)l件下真實(shí)的片段缺失或插入事件（圖1）。

圖1.小鼠模型與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

作者通過(guò)對(duì)片段缺失或插入圖譜的分析發(fā)現(xiàn)±1bp缺失或插入發(fā)生最頻繁，占總?cè)笔Щ虿迦胧录?5%左右（圖2）。對(duì)>1bp堿基插入的序列特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)大部分的堿基插入為鄰近序列的復(fù)制插入。發(fā)生在CDR3上的復(fù)制插入能夠增加CDR3的長(zhǎng)度，可能促進(jìn)廣譜中和抗體的產(chǎn)生。

圖2.抗體無(wú)功能等位基因上1bp和>1bp缺失或插入的占比

在體細(xì)胞高頻突變（Somatic Hypermutation, SHM）過(guò)程中，會(huì)伴隨著胞苷脫氨酶AID作用于抗體可變區(qū)基因的變化，導(dǎo)致DNA損傷。堿基切除修復(fù)途徑（base excision repair, BER）或錯(cuò)配修復(fù)途徑（mismatch repair, MMR）可以修復(fù)這些損傷，從而產(chǎn)生堿基突變以及DNA片段的缺失或插入。為了探究DNA片段缺失或插入產(chǎn)生的分子機(jī)制，本研究在抗體無(wú)功能等位基因小鼠模型基礎(chǔ)上構(gòu)建了15種具有代表性的DNA損傷應(yīng)答修復(fù)因子缺陷小鼠模型（圖1），并對(duì)其片段缺失或插入圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)的描繪（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)±1bp與>1bp缺失或插入產(chǎn)生的分子機(jī)制截然不同（圖3-4），1bp缺失通過(guò)BER途徑產(chǎn)生，1bp插入既可以通過(guò)BER途徑產(chǎn)生，也可以通過(guò)MMR途徑產(chǎn)生，產(chǎn)生過(guò)程需要核酸外切酶ExoI和易錯(cuò)DNA聚合酶Polη的參與。>1bp缺失或插入都是通過(guò)BER途徑產(chǎn)生的，并且都需要DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)因子53BP1的參與。此外，>1bp插入還需要非同源末端連接途徑和DNA聚合酶Polλ的參與。對(duì)片段缺失或插入分子機(jī)制的全面解析有助于理解廣譜中和抗體產(chǎn)生的機(jī)制，為廣譜中和抗體的生產(chǎn)提供了新的思路，為HIV等疫苗的設(shè)計(jì)提供了新的理論基礎(chǔ)。

圖3.抗體基因SHM中DNA片段缺失或插入機(jī)制的系統(tǒng)解析

作者在機(jī)制研究基礎(chǔ)上，本研究成功構(gòu)建了能夠增加抗體基因缺失或插入頻率的小鼠模型（圖3），核酸外切酶Trex2過(guò)表達(dá)的小鼠模型能夠促進(jìn)片段缺失的產(chǎn)生，DNA聚合酶Polβ條件性敲除的小鼠模型能夠促進(jìn)片段插入的產(chǎn)生。這兩種小鼠模型可以與人源化抗體小鼠模型聯(lián)合使用，用于疫苗的研發(fā)和廣譜中和抗體的生產(chǎn)。

圖4.抗體基因SHM中DNA片段缺失或插入機(jī)制的系統(tǒng)解析

作者克服了低頻事件檢測(cè)挑戰(zhàn)，通過(guò)獨(dú)特的乘客抗體基因(Passenger-lg)系統(tǒng)剖析了體細(xì)胞高頻突變過(guò)程中抗體基因片段插入或缺失的產(chǎn)生機(jī)制，并通過(guò)遺傳學(xué)手段獲得了能夠提高片段缺失或插入頻率的小鼠模型，為加速?gòu)V譜中和抗體的產(chǎn)生提供了理論支撐。