肝素是一種具有抗凝作用的哺乳動物多糖，已被廣泛用于治療各種血栓性疾病，如靜脈血栓栓塞；除血栓性疾病外，基礎研究和臨床實踐的累積證據(jù)表明，肝素治療可改善敗血癥的結局，敗血癥是一種主要死亡原因，定義為感染誘導的伴有器官功能障礙的危重癥。盡管相對清楚的是肝素如何發(fā)揮其抗凝作用，但肝素所能實現(xiàn)的免疫調節(jié)機制仍然是個謎。

2021年2月8日，中南大學呂奔團隊在Immunity 在線發(fā)表題為“Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties”的研究論文，該研究使用了集萃藥康斑點鼠（B6/JGpt-Hpse^em1Cd1095/Gpt, T017525），報道了肝素可預防敗血癥中caspase-11依賴性免疫反應和致死性，而與其抗凝特性無關。

正文

1、肝素阻止敗血癥中caspase-11依賴性免疫反應和致死性

研究者對野生型和caspase-11缺陷小鼠進行致死性內毒素血癥處理，并平行給予對照溶劑或肝素，發(fā)現(xiàn)肝素處理幾乎完全阻斷了IL-1a和IL-1b的釋放以及GSDMD的裂解，與肝細胞中caspase-11缺陷的程度相似；肝素給藥或caspase-11缺失可減弱致死性內毒素血癥的肺損傷并顯著促進存活（圖1）。

圖1.肝素阻止敗血癥中caspase-11依賴的免疫反應和致死性

2、肝素抑制caspase-11活化與其抗凝特性無關

研究者通過使用硫酸化肝素(NAH)（硫酸化肝素是一種化學修飾的肝素，不會發(fā)揮抗凝特性）來給藥。發(fā)現(xiàn)硫酸化非抗凝肝素(NAH)劑量依賴性地阻斷內毒素血癥中的caspase-11介導的免疫反應和動物致死性，而不影響TNF或IL-6的血漿濃度；NAH處理顯著降低了LPS激發(fā)后的凝血酶活化，其方式與caspase-11缺陷相似；NAH治療阻止LPS誘導的血漿TAT復合物、D-二聚體和PAI-1的增加，其方式與caspase-11缺陷相似（圖2）。

 圖2.肝素抑制caspase-11活化與其抗凝特性無關

3、肝素在體外選擇性抑制HMGB1和caspase-11依賴性免疫應答

研究者先用重組HMGB1蛋白與LPS誘導，發(fā)現(xiàn)WT而不是caspase-11缺陷的腹腔小鼠巨噬細胞釋放IL-1a、IL-1b和乳酸脫氫酶(LDH)以及GSDMD裂解且肝素呈劑量依賴性抑制Caspase-11依賴性免疫應答和GSDMD裂解（圖3）。

圖3.肝素在體外選擇性抑制重組HMGB1和caspase-11依賴性免疫應答

接著研究者用LPS和HMGB1 +/+ 或HMGB1-/-小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的壞死細胞裂解物刺激小鼠腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)僅來源于Hmgb1 +/+ MEFs的壞死細胞裂解物使LPS能夠以caspase-11依賴性方式誘導IL-1a和IL-1b的強烈釋放以及GSDMD裂解，此時加入肝素可以劑量依賴性地抑制IL-1a和IL-1b的釋放，并阻斷GSDMD的裂解。用HMGB1 +/+ 或HMGB1-/-小鼠肝細胞與小鼠腹腔巨噬細胞共培養(yǎng)，向細胞培養(yǎng)基中加入肝素可阻斷caspase-11依賴性免疫應答和GSDMD孔形成（圖4）。

 圖4.肝素在體外抑制內源性HMGB1和caspase-11依賴性免疫應答

4、肝素通過抑制HMGB1介導的LPS胞質轉運抑制caspase-11活化

研究者用LPS和HMGB1刺激巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)加入肝素可顯著降低巨噬細胞胞質中LPS的濃度；使用近端連接試驗(PLA)發(fā)現(xiàn)HMGB1顯著促進LPS-caspase-11相互作用，加入肝素可減少胞質中LPS-caspase-11相互作用；用肝細胞HMGB1缺陷小鼠及其對照小鼠進行致死性內毒素血癥，伴或不伴肝素處理，發(fā)現(xiàn)肝素處理顯著降低了對照小鼠而不是HMGB1缺陷小鼠脾細胞胞質中的LPS濃度（圖5）。

圖5.肝素通過抑制HMGB1介導的LPS胞質轉運來抑制caspase-11活化

5、 肝素直接抑制HMGB1-LPS結合

研究者通過表面等離子體共振(SPR)顯示肝素和NAH均能夠阻止HMGB1-LPS結合；使用PLA定量測定了HMGB1 + LPS- 刺激的巨噬細胞表面和內部的HMGB1-LPS復合物，加入肝素可顯著降低細胞表面或細胞內檢測到的HMGB1-LPS復合物數(shù)量（圖6）。

 圖6.肝素抑制HMGB1-LPS結合

6、肝素通過阻止乙酰肝素酶介導的糖萼降解抑制LPS的胞質轉運

研究者使用OMV刺激的小鼠巨噬細胞，加入肝素或NAH可顯著減少該巨噬細胞LPS胞質轉運；通過乙酰肝素酶的基因缺失或添加肝素或NAH可阻止HMGB1 + LPS或OMV刺激導致的糖萼的密度降低。使用重組乙酰肝素酶人工降解巨噬細胞的糖萼，導致胞質中LPS濃度增加（圖7）。

圖7.肝素通過阻止乙酰肝素酶介導的糖萼降解，抑制LPS的胞質轉運

結論

研究表明，肝素或無抗凝功能的硫酸化肝素(NAH)抑制了HMGB1與脂多糖（LPS）的結合，并可以阻止乙酰肝素酶降解巨噬細胞的糖萼，這些兩個過程的發(fā)生阻止了LPS的胞質傳遞和caspase-11的激活，進而阻止GSDMD的裂解成為GSDMD-NT。

臨床上接受肝素治療的敗血癥患者的生存率高于未接受肝素治療的敗血癥患者。然而，更廣泛使用肝素治療敗血癥的一個障礙是出血風險。無抗凝活性的改良肝素給藥對凝血無影響。這種以前未被認識的肝素功能的鑒定確立了先天性免疫反應和凝血之間的聯(lián)系。