2022年10月3日，廈門大學(xué)吳喬教授團隊在Nature Metabolism在線發(fā)表了題為“HK1 from hepatic stellate cell–derived extracellular vesicles promotes progression of hepatocellular carcinoma”的文章。該研究使用來自集萃藥康的Hk1f/f（品系編號：T052189）和Lrat-P2A-iCre（品系編號：T006205）小鼠模型進行研究，結(jié)合免疫熒光技術(shù)、GST pull-down實驗、蛋白質(zhì)組學(xué)分析等多個技術(shù)手段，揭示了肝星狀細胞中HK1通過胞外囊泡釋放后能夠加速肝癌進程的機制。同時篩選到一種抑制HCC進展的化合物PDNPA，為HCC的治療提供一種新策略。

1、TGF-β促纖維化過程中誘導(dǎo)HSCs分泌lEV HK1

為了研究纖維化過程中細胞間交流，研究者在LX-2肝星狀細胞中分別提取了胞外大囊泡和胞外小囊泡，進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)HK1是TGF-β刺激后胞外大囊泡中最為富集的蛋白之一。TGF-β能夠促進小鼠肝星狀細胞通過胞外大囊泡分泌HK1。研究者利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型進行研究，發(fā)現(xiàn)纖維化伴隨著胞外大囊泡外泌HK1。共聚焦結(jié)果顯示，TGF-β處理促進了HK1從線粒體向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移。此外，過量表達TSG101顯著增加了胞外大囊泡中HK1的分泌。表明HK1是通過胞外大囊泡從肝星狀細胞特異性分泌的，TGF-β誘導(dǎo)線粒體HK1運輸?shù)劫|(zhì)膜，而TSG101進一步協(xié)助HK1通過胞外大囊泡分泌。

圖1.TGF-β誘導(dǎo)肝纖維化中l(wèi)EV HK1的分泌

2、HK1的棕櫚?；龠M了HK1靶向質(zhì)膜的分泌

研究者發(fā)現(xiàn)用去棕櫚酰化酶抑制劑棕櫚抑素B（PalmB）或TGF-β處理能夠顯著增強HK1棕櫚?；潭?，而用棕櫚?；种苿?-溴棕櫚酸酯（2-BP）處理，則去除了HK1的棕櫚酰化。此外，即使用TGF-β處理，HK1在質(zhì)膜上的定位仍會被2-BP阻斷，而當(dāng)沒有TGF-β處理時，會被PalmB增強。表明TGF-β誘導(dǎo)的棕櫚酰化有利于HK1從線粒體轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，然后通過胞外大囊泡分泌。敲除去棕櫚?；窤BHD17B能夠明顯增強HK1的棕櫚?；头置冢⑶矣绊懥薚GF-β對HK1的誘導(dǎo)。因此，在肝纖維化過程中，TGF-β通過抑制ABHD17B依賴的HK1的去棕櫚酰化來促進HK1的分泌。

圖2.TGF-β誘導(dǎo)HK1棕櫚?；⑾蛸|(zhì)膜運輸

3、HCC細胞劫持來源于肝星狀細胞的lEV HK1以加速糖酵解過程

研究者對CCLE進行分析發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞表達的HK1水平相對較低。此外，通過共聚焦觀察及對肝癌相關(guān)模型進行實驗發(fā)現(xiàn)，HCC細胞中的HK1蛋白可能不是自身表達的，而是來源于對肝星狀細胞分泌的lEV HK1的攝取。鑒于HK1在糖酵解中的重要作用，作者研究發(fā)現(xiàn)Huh7和HepG2細胞葡萄糖吸收和胞外酸化率（ECAR）明顯升高的現(xiàn)象在HK1敲除的情況下沒有發(fā)生。當(dāng)重新表達HK1時，可以提高Huh7和HepG2細胞葡萄糖攝取量、ECAR的能力以及細胞增殖情況。此外，用糖酵解抑制劑處理Huh7和HepG2細胞時，lEVs不再促進細胞增殖。表明肝星狀細胞釋放的HK1通過糖酵解重編程促進HCC細胞的增殖。

圖3.HCC細胞劫持來源于肝星狀細胞的lEV HK1以促進糖酵解

4、HSC衍生的lEV HK1促進小鼠模型中的HCC進展

為了進一步探索lEV HK1與HCC之間的關(guān)系，作者對小鼠肝癌模型進行研究，發(fā)現(xiàn)lEV HK1顯著促進腫瘤生長，并且伴隨著Ki67的蛋白水平升高。通過對Hk1f/f與Gfap-Cre的小鼠進行雜交，得到在肝星狀細胞中 特異性敲除Hk1的小鼠（Hk1f/f；Gfap-Cre），其腫瘤生長及HK1和Ki67表達受到抑制。此外，研究者發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞來源的HK1能明顯促進肝癌的肺部轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移組織中的HK1表達升高，表明lEV HK1能夠促進腫瘤的進展。

圖4.不同條件誘導(dǎo)的小鼠模型證明了lEV HK1在促進HCC進展中的作用

5、Nur77抑制HSC分泌lEV HK1以抑制肝癌的發(fā)展進程

據(jù)報道，孤核受體Nur77可抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化。研究者通過將Nur77轉(zhuǎn)染到LX-2細胞中證實了這一點。Nur77能夠上調(diào)ABHD17B表達，敲除Nur77或敲除ABHD17B后，lEV HK1的分泌增多且棕櫚?；鰪姟１砻鱊ur77抑制lEV HK1棕櫚?；宰璧K HK1的分泌。研究者利用不同蛋白激酶的抑制劑處理LX-2細胞，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt途徑的抑制劑LY294002能阻斷TGF-β誘導(dǎo)的Nur77的降解。此外，當(dāng)HK1在肝星狀細胞中被特異性敲除時，Nur77的缺失不再影響腫瘤生長。表明Nur77通過抑制肝星狀細胞分泌lEV HK1，從而抑制肝癌的發(fā)展進程。

圖5.Nur77抑制HSC分泌lEV HK1

6、小分子PDNPA靶向Nur77以抑制lEV HK1的分泌

研究者通過篩選發(fā)現(xiàn)小分子化合物PDNPA能與Nur77配體結(jié)合域結(jié)合，由此阻礙了Akt與Nur77的相互作用，并且顯著修復(fù)TGF-β降低的Nur77蛋白水平，抑制HK1的外泌。此外PDNPA在基因和蛋白水平上恢復(fù)了ABHD17B的表達，從而阻止了TGF-β誘導(dǎo)的HK1棕櫚?；头置?。在小鼠肝細胞癌模型中，PDNPA能夠顯著減少腫瘤數(shù)目及腫瘤組織中HK1和Ki67的表達。在肝星狀細胞中 特異性刪除Nur77后，PDNPA作用被削弱。因此，PDNPA誘導(dǎo)的Nur77表達的升高通過抑制肝星狀細胞分泌lEV HK1從而抑制肝癌的發(fā)展進程。

圖6.PDNPA誘導(dǎo)Nur77的表達以抑制lEV HK1的分泌

結(jié)論

上述研究表明，在肝纖維化過程中，肝星狀細胞中TGF-β能通過PI3K-Akt途徑誘導(dǎo)Nur77降解，導(dǎo)致ABHD17B的表達受到抑制，因此增強了HK1的棕櫚酰化，促進HK1轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜并通過lEVs分泌。而肝星狀細胞來源的lEV HK1能夠被HCC細胞劫持來促進糖酵解重編程和肝癌的發(fā)展進程。此外，研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物PDNPA靶向Nur77以抑制TGF-β誘導(dǎo)的HK1分泌，從而有效延緩肝癌發(fā)病。

補充知識：

肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）主要參與肝臟纖維化，并且與肝細胞癌（HCC）關(guān)系密切[1-2]。大多數(shù)HCC病例是在嚴(yán)重的肝臟纖維化或肝硬化的情況下發(fā)生的。促纖維化細胞因子TGF-β在發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)過程中調(diào)節(jié)著各種過程，在纖維化的肝臟中明顯增加以激活肝星狀細胞[3]。臨床數(shù)據(jù)顯示，活化的肝星狀細胞與HCC患者的預(yù)后不佳有關(guān)，并以多種方式影響HCC的發(fā)展[4-5]。胞外囊泡（EVs）在腫瘤微環(huán)境的細胞間交流中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可作為早期HCC診斷的生物標(biāo)志物[6-7]。研究EV介導(dǎo)的HCC細胞和肝星狀細胞之間的相互作用有望進一步促進臨床治療。糖酵解重編程也是肝臟纖維化的一個重要特征[8]。Hexokinase（HK）是糖酵解的重要限速酶之一，對葡萄糖的利用至關(guān)重要。最近，HK1被認(rèn)為可以促進腫瘤的代謝重編程[9]，然而HK1在HCC進展中的功能尚不明確。

參考文獻

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[4]Han, S. et al. Activated hepatic stellate cells promote hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via the activation of FAK-MMP9 signaling. Oncol. Rep. 31, 641–648 (2014).

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[7]Li, X. et al. The significance of exosomes in the development and treatment of hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer 19, 1 (2020).

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[9]Amendola, C. R. et al. KRAS4A directly regulates hexokinase 1. Nature 576, 482–486 (2019).