胰島素（Insulin）是mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的有效誘導(dǎo)劑，有助于代謝調(diào)節(jié)。尤其是飯后，胰島素會(huì)引起多種代謝反應(yīng)，控制體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)激增，并維持代謝健康。相反的，胰島素抵抗會(huì)破壞體內(nèi)代謝平衡，引發(fā)與肥胖相關(guān)的代謝性疾病，包括Ⅱ型糖尿病、代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病等。盡管過去幾十年對(duì)于胰島素以及代謝性疾病的研究一直在進(jìn)行，但胰島素的作用與抵抗機(jī)制與這些病理的聯(lián)系仍未得到充分認(rèn)識(shí)。同時(shí)，胰島素可能與調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性的加工體（processing body，P-body）有聯(lián)系。但是胰島素究竟能否以及怎樣通過P-body調(diào)控mRNA穩(wěn)定性目前尚無報(bào)道。

集萃藥康TRIM24點(diǎn)突變小鼠模型助力南大模式研究

2022年7月，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院模式動(dòng)物研究所陳帥/王宏宇團(tuán)隊(duì)在Nature Communications在線發(fā)表了題為“TRIM24 is an insulin-responsive regulator of P-bodies”的文章，報(bào)道了利用TRIM24點(diǎn)突變小鼠模型，探究TRIM24在胰島素調(diào)控P-body的功能中的作用，同時(shí)對(duì)脂肪肝的治療也具有深遠(yuǎn)意義。（本研究所采用的點(diǎn)突變模型TRIM24S1043A，即B6/JGpt-Trim24em1Cin(S1043A)/Gpt，由集萃藥康構(gòu)建。）

1.TRIM24是肝臟中受胰島素調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白

為了了解胰島素如何調(diào)節(jié)肝功能，研究者使用胰島素處理小鼠，并借助通用磷酸化Akt底物（PAS）抗體檢測(cè)肝臟中的蛋白質(zhì)。在之前的研究中，TRIM蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是PI-3K-PKB途徑的調(diào)節(jié)因子，但是胰島素在其中是否起到作用，或者如何起到作用的機(jī)制尚不明確。TRIM24作為被確定的潛在PAS反應(yīng)蛋白，在本研究中也被確定為胰島素反應(yīng)中潛在的磷酸化蛋白。一方面研究者發(fā)現(xiàn)PAS免疫沉淀物中存在TRIM24，另一方面在HEK293細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白GFP-TRIM24的研究中，發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激時(shí)，TRIM24的PAS反應(yīng)性磷酸化增加，而PI-3K抑制劑或PKB/Akt抑制劑預(yù)處理該細(xì)胞，PAS反應(yīng)則會(huì)被抑制。這些數(shù)據(jù)表明了TRIM24是一種PKB/Akt底物，胰島素會(huì)刺激其磷酸化（圖1）。

圖1.TRIM24受到胰島素刺激通過PI-3K-PKB途徑磷酸化

2.胰島素通過將TRIM24的第1043位的絲氨酸(Ser)的磷酸化將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì) 

TRIM24是一種核蛋白，具有兩個(gè)預(yù)測(cè)的獨(dú)立核定位信號(hào)（NLS）。NLS1位于該基因的903-912個(gè)氨基酸，NLS2位于該基因的1034-1046個(gè)氨基酸。在本研究中胰島素刺激降低了HEK293細(xì)胞中GFP-TRIM24在核中的豐度，提高了其在胞質(zhì)基質(zhì)的豐度，這意味著一部分GFP-TRIM24從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)中，并形成穿刺點(diǎn)分散在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。有趣的是，使用核輸出抑制劑（Lmb）處理，則會(huì)阻斷胰島素誘導(dǎo)的胞質(zhì)GFP-TRIM24增加，以及核GFP-TRIM24的減少（圖2）。

圖2.胰島素可以誘導(dǎo)TRIM24的核質(zhì)定位改變

上述數(shù)據(jù)揭示TRIM24磷酸化可能控制其在胰島素作用下核質(zhì)定位改變。結(jié)合胰島素誘導(dǎo)的PAS反應(yīng)性磷酸化位點(diǎn)位于TRIM24的C端的研究背景，同時(shí)Ser1043以及周圍序列符合PAS抗體的結(jié)合基序。研究者替換含有非磷酸化丙氨酸（Ala）的Ser1043阻斷了胰島素/PKB介導(dǎo)的TRIM24的PAS反應(yīng)性磷酸化，在細(xì)胞內(nèi)和體外都是如此。因此，作者采用了一種位點(diǎn)特異性抗體用于識(shí)別磷酸化的Ser1043(pSer1043)。結(jié)果表明胰島素顯著增加了GFP-TRIM24上Ser1043的磷酸化，當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)锳la時(shí)，磷酸化被阻止。當(dāng)Ser1043突變成類似磷酸化的天冬氨酸（Asp）,可以發(fā)現(xiàn)GFP-TRIM24S1043D突變蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，GFP-TRIM24S1043A突變主要存在于細(xì)胞核，并且胰島素不能再將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。值得注意的是，在不考慮胰島素刺激的情況下，GFP-TRIM24S1043D突變蛋白會(huì)形成胞質(zhì)病灶，這與胰島素刺激下GFP-TRIM24的變化相似。綜上所述，胰島素通過促進(jìn)TRIM24中Ser1043磷酸化，從而將其從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中（圖3）。

圖3.胰島素促進(jìn)TRIM24中Ser1043磷酸化，改變TRIM24的核質(zhì)定位。

3.TRIM24與胞質(zhì)P-bodies關(guān)鍵成分的交互作用 

為了了解TRIM24在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的潛在作用，研究者在HEK293細(xì)胞中表達(dá)GFP-TRIM24融合蛋白。通過免疫沉淀，借助質(zhì)譜法鑒定免疫沉淀物中的蛋白質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)了多種P-bodies的成分，包括LSM1，EDC4，AGOs和GW182。通過免疫印跡驗(yàn)證了包括上述蛋白質(zhì)以及P-bodies的另外兩個(gè)標(biāo)記物DDX6和DCP1。同樣在肝裂解物的內(nèi)源性TRIM24的免疫沉淀物中也檢測(cè)到內(nèi)源性的上述蛋白。EDC4、AGO1和AGO2與GFP-TRIM24共表達(dá)的結(jié)果也證明了GFP-TRIM24與部分P-bodies組分之間的相互作用。研究者進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅在胞質(zhì)GFP-TRIM24S1043D與mCherry-LSM1共表達(dá)，同時(shí)部分EDC4、AGO1和AGO2也被檢測(cè)出。這意味著P-bodies可能存在多種類型，細(xì)胞質(zhì)中的TRIM24可能與其部分亞群有關(guān)（圖4）。

圖4.胞質(zhì)TRIM24與P-bodies的相互作用

4.TRIM24通過多聚泛素化調(diào)節(jié)EDC4和AGO2 

TRIM24是一種具有環(huán)形E3連接酶結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白質(zhì)，因此研究者探究其是否可能泛素化調(diào)節(jié)EDC4。研究表明，TRIM24與EDC4在HEK293細(xì)胞中的共表達(dá)增加了EDC4蛋白的泛素化；相反的，破壞環(huán)形區(qū)域或者引起連接酶死亡的TRIM24C52/55A突變顯示出泛素化EDC4的能力受損?；谏鲜鼋Y(jié)果，研究者通過碎片分析，發(fā)現(xiàn)EDC4M1-H538包含與TRIM24相互作用的WD40域片段。最后通過生物素識(shí)別確定了TRIM24與EDC4的相互作用，并引起EDC4泛素化。同樣的，研究者也發(fā)現(xiàn)了TRIM24能夠引起AGO2泛素化，環(huán)形結(jié)構(gòu)域缺失或者TRIM24C52/55A突變會(huì)抑制AGO2泛素化（圖5）。

圖5.TRIM24與EDC4和AGO2的相互作用和泛素化影響

 5.抑制TRIM24E3連接酶活性可以下調(diào)肝臟中脂肪合成基因的表達(dá)從而減弱飲食誘導(dǎo)的脂肪肝

 為了研究TRIM24與P-bodies在體內(nèi)的實(shí)際作用，通過構(gòu)建TRIM24C52/55A突變小鼠，在不影響TRIM24蛋白在小鼠中表達(dá)的前提下，使用胰島素處理能夠增加TRIM24的胞質(zhì)豐度，并降低核內(nèi)豐度。盡管正常飲食對(duì)該突變小鼠肝臟甘油三酯含量沒有影響，但高脂飼料誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪肝癥狀時(shí)，突變小鼠能通過降低肝臟甘油三酯積累，顯著緩解脂肪肝癥狀。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TRIM24C52/55A中，PPAR信號(hào)傳導(dǎo)和脂肪酸代謝途徑均被抑制。PPARγ是肝脂代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，研究者進(jìn)一步評(píng)價(jià)了其控制肝細(xì)胞的脂質(zhì)儲(chǔ)存，TRIM24C52/55A突變與對(duì)照相比具有更小的脂滴儲(chǔ)存，PPARγ的過表達(dá)則會(huì)恢復(fù)這種變化。綜上，E3連接酶能夠調(diào)控PPARγ信號(hào)傳導(dǎo)，從而緩解高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝（圖6）。

圖6.TRIM24C52/55A突變小鼠脂質(zhì)代謝的變化

6.TRIM24通過P-bodies調(diào)節(jié)Pparγ的mRNA穩(wěn)定性

研究者進(jìn)一步探究了TRIM24 E3連接酶失活如何在mRNA水平下調(diào)Pparγ。使用放線菌素D（ActD）處理評(píng)價(jià)Pparγ的mRNA穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)了TRIM24C52/55A突變的負(fù)面效應(yīng)。由于胞質(zhì)TRIM24與P-bodies關(guān)聯(lián)在本研究被證實(shí)，進(jìn)一步在熒光原位雜交試驗(yàn)中，顯示一部分Pparγ mRNA存在于胞質(zhì)TRIM24點(diǎn)狀體以及存在于LSM1標(biāo)記的P-bodies中。RNA的免疫沉淀測(cè)定結(jié)果也表明了TRIM24的E3連接酶活性通過P-bodies調(diào)節(jié)Pparγ mRNA的穩(wěn)定性。但是研究者通過進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)TRIM24除了調(diào)節(jié)Pparγ mRNA穩(wěn)定性外可能無法調(diào)節(jié)Pparγ mRNA翻譯（圖7）。

圖7.TRIM24通過P-bodies調(diào)節(jié)Pparγ的穩(wěn)定性

7.TRIM24S1043A突變通過減弱肝臟對(duì)脂肪合成基因的表達(dá)，緩解飲食誘導(dǎo)的脂肪肝

同樣的，研究者通過構(gòu)建TRIM24S1043A突變小鼠探究了TRIM24-Ser1043磷酸化對(duì)體內(nèi)P-bodies的調(diào)節(jié)作用。正如預(yù)期那樣，胰島素刺激TRIM24磷酸化并將其轉(zhuǎn)移到野生小鼠的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，但不能引起突變小鼠相應(yīng)磷酸化和胞質(zhì)易位。該突變小鼠肝臟甘油三酯積累效應(yīng)與TRIM24C52/55A突變小鼠相似。然而，通過下調(diào)LSM1或EDC4可以恢復(fù)TRIM24S1043A突變小鼠中Pparγ的表達(dá)，表明P-bodies對(duì)肝臟Pparγ表達(dá)調(diào)控的重要性，建立了小鼠體內(nèi)P-bodies和Pparγ表達(dá)之間的因果關(guān)系（圖8）。

圖8.TRIM24S1043A小鼠肝臟脂代謝的變化

結(jié)論

本研究通過TRIM24C52/55A以及TRIM24S1043A小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)了TRIM24是將胰島素信號(hào)傳導(dǎo)與mRNA穩(wěn)定性聯(lián)系起來的P-bodies的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。這一新的胰島素作用機(jī)理可為脂肪肝疾病的治療提供新的潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。