裸鼠作為免疫缺陷研究的“老將”，常常會打破大家的認知，長出一些毛發(fā)——但這真的意味著它們的免疫系統(tǒng)“恢復”了嗎？今天，我們就來聊聊裸鼠長毛背后的科學邏輯，以及真正影響荷瘤實驗的關(guān)鍵因素。

了解裸鼠

Foxn1基因（forkhead box N1，又稱 Hfh11、Fkh19）是胸腺上皮細胞中的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和代謝，在癌癥和衰老中發(fā)揮重要作用[1]。當小鼠的Foxn1基因發(fā)生純合突變時，會引發(fā)兩大標志性缺陷：

· 胸腺上皮發(fā)育缺陷：T細胞無法成熟，造成免疫缺陷；

· 毛發(fā)生長異常：角蛋白分泌紊亂，導致毛發(fā)無法正常穿透皮膚，表現(xiàn)為扭曲、斷裂的毛發(fā)，看似"無毛"。因此讓突變小鼠獲得了"裸鼠"的稱號。

裸鼠為什么長毛？

由于Foxn1基因功能缺失，毛桿中缺乏角蛋白，變得非常纖弱，絕大部分毛桿不能正常穿透表皮，而是扭曲盤繞在膨脹的毛囊漏斗內(nèi)，因此裸鼠皮膚眼觀上為光裸的。但從組織學切片來看，裸鼠毛囊與同窩出生的正常有毛鼠相比，毛囊數(shù)量和功能均沒有差別，能夠產(chǎn)生正常的毛根和毛桿^[2]。

圖1. 6日齡小鼠毛囊縱切面^[2]（a.正常鼠 b.裸鼠）

由于裸鼠皮膚眼觀上為光裸的，很容易由此引起了人們的誤解：“裸鼠”就是“體表無毛的”。但實際上裸鼠出生后約10天左右，在頭部、頸部可見稀疏的毛發(fā)生長。隨著周齡增加，在軀干的其他部位也可見稀疏毛發(fā)生長。這些穿透了表皮的毛桿也是嚴重扭曲的，而且經(jīng)常在長到應(yīng)有長度前就折斷了。因此大家看到的是稀疏、較短的被毛。

根據(jù)我們的繁育經(jīng)驗：裸鼠在4w時會出現(xiàn)長毛（長毛高峰期），到6w之間會出現(xiàn)周期性的長毛及褪毛，7w時部分小鼠再次長毛，此時毛發(fā)不易脫落。

裸鼠長毛是免疫缺陷能力恢復嗎？

上文提到，裸鼠因Foxn1基因突變導致毛發(fā)生長異常和胸腺發(fā)育缺陷兩種主要表型，但這兩種表型是獨立的，移植胸腺不會改善毛發(fā)情況。Gordon J. Eaton團隊研究比較了裸鼠(nu/nu)、接受胸腺移植的裸鼠(nu/nu)以及雜合子(nu/+)小鼠的毛發(fā)生長情況，發(fā)現(xiàn)接受胸腺移植的裸鼠免疫功能可恢復，但其毛發(fā)生長規(guī)律與未接受移植的裸鼠一致，說明胸腺缺失與否和毛發(fā)生長規(guī)律無直接關(guān)系^[3]。

對此，我們專門開展了相關(guān)驗證實驗，對5周齡長毛裸鼠和5周齡無明顯毛發(fā)裸鼠進行免疫細胞流式檢測，分析長毛現(xiàn)象與免疫缺陷是否具有關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示長毛裸鼠具有正常的免疫缺陷表型，與是否長毛關(guān)。

圖2. 長毛BALB/c-Nude的外觀（從上到下編號分別為A1-A5，雄鼠，5周齡）

圖3. 體表無明顯毛發(fā)的BALB/c-Nude及BALB/cJGpt對照小鼠外觀（從上到下分別為A6-A9，雄鼠，5周齡）

圖4. 長毛BALB/c-Nude及無明顯毛發(fā)BALB/c-Nude流式檢測結(jié)果

（A1-A5為長毛BALB/c-Nude、A6-A8為無明顯毛發(fā)BALB/c-Nude、A9為BALB/cJGpt對照）

用裸鼠進行荷瘤實驗，關(guān)鍵因素有哪些？

影響成瘤的因素較多，與細胞系本身特性、細胞狀態(tài)、細胞傳代次數(shù)、支原體污染與否、接種部位、接種量、小鼠的周齡、性別、適應(yīng)性飼養(yǎng)及飼養(yǎng)環(huán)境等都息息相關(guān)，當出現(xiàn)荷瘤效果不理想時，需要針對性的逐一分析。以皮下CDX接種為例，小編總結(jié)了影響實驗效果的關(guān)鍵質(zhì)控點：

1.實驗方案設(shè)計

文獻調(diào)研，首先了解細胞系適宜接種的小鼠及性別等模型信息；其次了解常見接種位點、接種劑量、是否需要添加基質(zhì)膠等接種條件。建議正式實驗之前開展預實驗，進行成瘤測試，收集數(shù)據(jù)以摸索最佳接種條件。可瀏覽以下網(wǎng)頁，查看藥康體系下的成瘤數(shù)據(jù)：

https://cn.www.pubugu.com/service/cdx.html

2. 小鼠環(huán)節(jié)

小鼠在運輸過程中會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使小鼠出現(xiàn)一系列的病理生理學變化，這些變化會增加某些實驗誤差，因此在接到動物后應(yīng)盡量避免立即進行實驗，建議讓動物有1~2周的適應(yīng)期。免疫缺陷小鼠對飼養(yǎng)環(huán)境的要求高，必須飼養(yǎng)在SPF級屏障設(shè)施內(nèi)，且與免疫正常小鼠飼養(yǎng)在不同房間。如果環(huán)境設(shè)施不達標，有可能會間接影響腫瘤模型的制備。裸鼠長期暴露在弱抗原的刺激下，NK等免疫細胞的活力逐步增強，會導致裸鼠對腫瘤的非特異性免疫力增強。

3. 細胞環(huán)節(jié)

細胞狀態(tài)：建議取處于對數(shù)期生長的細胞進行接種，避免體外過度傳代影響細胞狀態(tài)。

支原體檢測：接種前對細胞進行支原體檢測。支原體污染極為常見，會改變培養(yǎng)細胞的代謝、增殖特征及形態(tài)等，從而影響腫瘤生長和結(jié)果的可重復性[4]。

細胞活率：細胞活力是影響腫瘤形成的重要原因，建議接種前后均進行細胞活率檢測，細胞活率90%以上為宜，確保接種過程中細胞活率沒有明顯降低。

細胞濃度：以活細胞數(shù)量為準，調(diào)整細胞濃度。

4. 接種環(huán)節(jié)

細胞混勻：接種前和接種過程中均需注意混勻細胞，建議接種過程中每次吸取細胞均要上下顛倒混勻，每次接種2籠小鼠使用槍頭輕輕吹打混勻。

添加基質(zhì)膠（如需要）：建議提前一天將基質(zhì)膠置于碎冰盒中，放置于 4℃冰箱過夜融化；基質(zhì)膠混勻，動作輕柔，避免過多氣泡產(chǎn)生，且整個過程需放置在碎冰中。

皮下注射：使用75%酒精消毒接種區(qū)域皮膚，進針角度小于30°，進針過程中不要挑針，使針頭平穩(wěn)的在皮下移動，直至三分之一左右的針頭進入小鼠皮下，此時針尖位置在接種點附近緩慢注射細胞懸液；注射后，針頭輕微旋轉(zhuǎn)，緩慢抽出。操作結(jié)束后注意觀察注射部位是否有出血，小鼠是否活動異常等情況。

注意：整個接種過程建議在2h內(nèi)完成；接種時細胞懸液應(yīng)一直置于4℃環(huán)境中，使其維持恒定溫度保證細胞活力。

5. 觀測環(huán)節(jié)

腫瘤體積計算公式為：腫瘤體積（mm3）=0.5×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。由于不同實驗人員測量之間可能存在誤差，建議同一個實驗中由同一個研究人員測量所有小鼠的腫瘤大小，以盡量避免腫瘤的測量誤差。以下為我司腫瘤觀察測量方式：

· 小鼠保定，觀察接種位置的腫瘤形態(tài)

為防止腫瘤在保定過程中被拉扯變形（下圖1B、1C、2B、2C），保定時應(yīng)使腫瘤周邊皮膚相對松弛（下圖1A、2A），同時注意保定小鼠頭部及鼠尾，防止其回頭咬傷實驗人員。

圖4. 以NCG小鼠為例，不同保定力度下腫瘤外觀及形態(tài)示意圖（A.松弛狀態(tài)，B.拉伸狀態(tài)，C.過度拉伸狀態(tài)）

· 酒精棉擦拭，清晰腫瘤形態(tài)

使用75%酒精棉球擦拭腫瘤表面及周邊皮膚，使腫瘤輪廓更加清晰（圖5）后進行腫瘤測量。注意：不應(yīng)使用過于濕潤的酒精棉球，以擦拭腫瘤表面后無明顯液體為宜。測量時以腫瘤恰可以從游標卡尺外測量爪中通過的讀數(shù)為準。

圖5. 以NCG小鼠為例，酒精棉球擦拭后腫瘤形態(tài)（A.未擦拭，B.酒精棉球擦拭后）

通過以上介紹，相信大家都有了更清晰的認識，裸鼠長毛其實是一種正常的生理現(xiàn)象，這些"叛逆"的小毛發(fā)只是Foxn1基因突變帶來的外表特征，不代表免疫缺陷能力的恢復。嚴格把控實驗細節(jié)，方能一路披荊斬棘。

參考文獻

[1] Nowell CS, Bredenkamp N, Tetélin S, et al. Foxn1 regulates lineage progression in cortical and medullary thymic epithelial cells but is dispensable for medullary sublineage divergence. PLoS Genet. 2011;7(11):e1002348.

[2] Flanagan SP. 'Nude', a new hairless gene with pleiotropic effects in the mouse. Genet Res. 1966;8(3):295-309.

[3] Eaton GJ. Hair growth cycles and wave patterns in "nude" mice. Transplantation. 1976;22(3):217-222.

[4] Stribbling SM, Ryan AJ. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 2022;17(9):2108-2128.