細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4（Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA4）又名CD152，是由CTLA4基因編碼的一種白細(xì)胞分化抗原，屬于免疫球蛋白超家族。 CTLA4基因編碼膜蛋白，其胞外區(qū)為受體/配體結(jié)合區(qū)，胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)。

T細(xì)胞中主要表達(dá)CTLA4的細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），是一類可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的T細(xì)胞。目前認(rèn)為CTLA4的功能為調(diào)控Treg定位。CTLA4的胞外區(qū)能夠與CD28競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合APC（抗原遞呈細(xì)胞）表面的B7分子配體（CD80/CD86），產(chǎn)生抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞激活，使腫瘤細(xì)胞免受T淋巴細(xì)胞攻擊。因此阻斷CTLA4的免疫效應(yīng)可刺激免疫細(xì)胞大量增殖，從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)^[1-2]。

構(gòu)建策略： 集萃藥康利用基因編輯技術(shù)將BALB/c及C57BL/6小鼠CTLA4胞外區(qū)替換為對(duì)應(yīng)的人源片段，而胞內(nèi)區(qū)則保留完整的鼠源序列，開發(fā)了CTLA4人源化小鼠模型，包括單人源化小鼠BALB/c-hCTLA4及C57BL/6-hCTLA4和雙人源化小鼠BALB/c-hPD1/hCTLA4及C57BL/6-hPD1/ hCTLA4。CTLA4人源化小鼠模型是人CTLA4抑制劑藥效評(píng)價(jià)及安全性評(píng)價(jià)的理想動(dòng)物模型。

1. BALB/c-hCTLA4：YERVOY^?藥效實(shí)驗(yàn)

在BALB/c-hCTLA4小鼠模型皮下接種CT26.WT腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)的腫瘤抑制藥效

左圖：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線    右圖：小鼠體重變化曲線

基于BALB/c-hCTLA4小鼠皮下接種CT26.WT模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT移植到BALB/c-hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤平均體積約100 mm³時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組(n=7)。并使用相應(yīng)劑量的藥物進(jìn)行治療。每周給藥2次，共給藥4次。數(shù)據(jù)以Mean ± SEM形式呈現(xiàn)。

結(jié)果顯示：抗人CTLA4抗體Yervoy對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有非常明顯的抑制作用。

結(jié)果證明：BALB/c-hCTLA4小鼠是評(píng)估人CTLA4抗體體內(nèi)藥效的有力工具。

2. BALB/c-hCTLA4：YERVOY^?劑量藥效驗(yàn)證

在BALB/c-hCTLA4小鼠模型皮下接種CT26.WT腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)的腫瘤抑制量效關(guān)系。

左圖：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線    右圖：小鼠體重變化曲線

基于BALB/c-hCTLA4小鼠皮下接種CT26.WT模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT移植到BALB/c-hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤平均體積約100 mm³時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組(G1)和治療組(G2-G5)。數(shù)據(jù)使用Mean ± SEM表示。

結(jié)果顯示：抗人CTLA4抗體Yervoy在高劑量治療組(G3:TGI=96%; G4:TGI=91%;G5:TGI=87.5%)，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有非常明顯的抑制作用；而在低劑量治療組具有部分抗腫瘤藥效（TGI=39.6%）。

結(jié)果證明：BALB/c-hCTLA4小鼠是評(píng)估人CTLA4抗體體內(nèi)藥效的有力工具。

3. C57BL/6-hCTLA4：YERVOY^?藥效實(shí)驗(yàn)

在B6-hCTLA4小鼠模型皮下接種MC38腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)的腫瘤抑制藥效。

左圖：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線  右圖：小鼠體重變化曲線

基于B6-hCTLA4小鼠皮下接種MC38模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。 將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38移植到B6-hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤平均體積約100 mm³時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組（對(duì)照組n=5,治療組n=7）。并使用相應(yīng)劑量的藥物進(jìn)行治療。每3天給藥1次，共給藥6次。數(shù)據(jù)以Mean ± SEM形式呈現(xiàn)。

結(jié)果顯示：抗人CTLA4抗體Yervoy對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有非常明顯的抑制作用（TGI=100%）。

結(jié)果證明： B6-hCTLA4小鼠是評(píng)估人CTLA4抗體體內(nèi)藥效的理想動(dòng)物模型。

4. C57BL/6-hCTLA4：YERVOY^?劑量藥效驗(yàn)證

在B6-hCTLA4小鼠模型皮下接種MC38腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)的腫瘤抑制量效關(guān)系。

左圖：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線  右圖：小鼠體重變化曲線

基于B6-hCTLA4小鼠皮下接種MC38模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。 將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38移植到B6-hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤平均體積約100 mm³時(shí)將動(dòng)物入組至對(duì)照組(G1，N=6)和治療組(G2-G3,N=6; G4-G5,N=5)。數(shù)據(jù)以Mean ± SEM形式呈現(xiàn)。

結(jié)果顯示：抗人CTLA4抗體Yervoy在高劑量治療組(G3:TGI=85%;G4:TGI=99%;G5:TGI=99%)，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有非常明顯的抑制作用；而在低劑量治療組具有部分的抗腫瘤藥效（TGI=22%）。

結(jié)果證明：B6-hCTLA4小鼠是評(píng)估人CTLA4抗體體內(nèi)藥效的有力工具。

5. 應(yīng)用BALB/c-hPD1/hCTLA4評(píng)價(jià)化合物抗腫瘤效果

在BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠模型皮下接種CT26.WT腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)及抗人PD1抗體KERTRUDA^?的腫瘤抑制效果。

小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

基于BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠皮下接種CT26.WT模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT接種至6-8周齡BALB/c-hPD1/hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至平均體積100 mm³時(shí)隨機(jī)分為PBS組，lpilimumab和 Keytruda 單藥給藥組及l(fā)pilimumab和 Keytruda聯(lián)合給藥組 (n=7)，并使用相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療。每三天給藥1次，共給藥7次。數(shù)據(jù)以Mean ± SEM形式呈現(xiàn)。

結(jié)果顯示： lpilimumab和Keytruda單藥給藥組腫瘤體積抑制率（TGI）分別為59.38%、50.52%； lpilimumab和 Keytruda聯(lián)合給藥組的TGI為87.45%，均對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。

結(jié)果表明： BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠是評(píng)價(jià)人源CTLA4抗體、PD-1抗體及聯(lián)合用藥的抗腫瘤藥效的理想動(dòng)物模型。

 6. 應(yīng)用C57BL/6-hPD1/hCTLA4評(píng)價(jià)化合物抗腫瘤效果

在B6-hPD1/hCTLA4小鼠模型皮下接種MC38腫瘤細(xì)胞系后測(cè)試抗人CTLA4抗體YERVOY^?（Ipilimumab)及抗人PD1抗體Opdivo^?的腫瘤抑制效果。

小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

基于B6-hPD1/hCTLA4小鼠皮下接種MC38模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞MC38接種至6-8周齡B6-hPD1/hCTLA4人源化小鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至平均體積100 mm³ 時(shí)隨機(jī)分為Control組，lpilimumab組、Opdivo組和lpilimumab與 Opdivo聯(lián)合用藥組 (n=5)，并使用相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療。每三天給藥1次，共給藥6次。數(shù)據(jù)以Mean ± SEM形式呈現(xiàn)。

結(jié)果顯示：lpilimumab組、Opdivo組和lpilimumab與Opdivo聯(lián)合用藥組的腫瘤體積抑制率（TGI）分別為42.10%，69.77%和87.19%。單藥組及聯(lián)合用藥組均對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且聯(lián)合用藥組抗腫瘤效果更顯著。

結(jié)果表明： B6-hPD1/hCTLA4小鼠是評(píng)價(jià)人源CTLA4抗體、PD-1/PD-L1抗體及聯(lián)合用藥或雙特異性抗體的抗腫瘤藥效的理想動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)

[1] Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies. Int Immunol. 2015, 27(1):3-10.

[2] Blockade of CTLA-4 on both effector and regulatory T cell compartments contributes to the antitumor activity of anti?CTLA-4 antibodies. J Exp Med. 2009,3;206(8):1717-25.