寨卡病毒、冠狀病毒、流感病毒等 RNA 病毒，憑借極高的突變率與快速進化能力，頻繁引發(fā)全球性流行病，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。在此背景下，抗病毒藥物開發(fā)進展如何？在相關研究中，條件性敲除小鼠模型如何發(fā)揮作用？集萃藥康帶你了解。

01. 導言

傳統(tǒng)抗病毒策略大多聚焦于靶向病毒保守蛋白，但病毒基因組的快速變異特性，易引發(fā)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。因此，以宿主因子為靶點開發(fā)廣譜抗病毒藥物，已成為突破耐藥性瓶頸的重要研究方向。近年來的研究顯示，病毒依賴宿主的囊泡運輸系統(tǒng)完成自身復制與釋放過程，然而，宿主因子調(diào)控病毒囊泡運輸?shù)姆肿訖C制尚不清晰，如何實現(xiàn)對宿主靶點的特異性干預，仍是該領域面臨的重大挑戰(zhàn)。

ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factors, ARFs)）作為一類調(diào)控囊泡運輸?shù)腉TP酶，在細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著關鍵作用。不過，其是否參與病毒感染進程，此前尚未有明確結(jié)論。2025年2月，中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院秦成峰團隊在《Nature Microbiology》上發(fā)表了題為“ARF4-mediated intracellular transport as a broad-spectrum antiviral target”的研究論文。研究中，團隊選用集萃藥康的Arf4-KO（品系編號：T012444）小鼠模型，結(jié)合細胞系構(gòu)建等前沿技術(shù)，首次揭示了ARF4在調(diào)控病毒運輸和釋放中的核心作用，并證實靶向ARF4的抑制劑具備廣譜抗病毒潛力，為新型抗病毒藥物研發(fā)開辟全新路徑。

02. 研究結(jié)果

• ARF4在寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)感染中的關鍵作用

研究團隊首先通過構(gòu)建ARF4、ARF5基因敲除的細胞系，實驗結(jié)果表明，敲除ARF4能顯著抑制ZIKV的感染和復制過程，而敲除ARF5則無此效果。在動物實驗層面，ARF4條件性敲除小鼠（Arf4-flox×Prok2-Cre）在ZIKV感染后，其血清、腦和睪丸中的病毒血癥和病毒載量均顯著降低，同時，ZIKV引發(fā)的典型病理變化，如腦部炎癥細胞浸潤、睪丸曲細精管壞死等癥狀也明顯減輕。綜合實驗結(jié)果，確定了ARF4是ZIKV感染過程中不可或缺的關鍵宿主因子。

圖1. ARF4在ZIKV感染中的必要作用

• ZIKV感染激活ARF4并促進病毒后代的產(chǎn)生

ZIKV的生命周期與宿主ARF4的激活/沉默狀態(tài)緊密相連。研究證實，ZIKV感染能夠顯著提升ARF4的激活水平（GTP結(jié)合態(tài)）。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，在ARF4敲除細胞中，回補持續(xù)激活狀態(tài)的ARF4突變體（Q71I）或野生型ARF4，可使病毒復制得以回復；而回補失活突變體（T31N）則完全阻斷病毒子代產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，ZIKV感染可大幅增加ARF4的激活水平，而只有具有表達失活性的ARF4突變體才能支持病毒復制，即ARF4激活是病毒復制的必要條件。

圖2. ZIKV感染激活ARF4并促進病毒后代的產(chǎn)生

• ARF4調(diào)控ZIKV的細胞內(nèi)運輸與釋放

盡管ARF4缺失會使培養(yǎng)基中子代病毒顆粒的釋放量顯著減少，但在感染早期，細胞內(nèi)的病毒RNA水平并未受影響，這表明ARF4主要在ZIKV的分泌階段發(fā)揮作用。重組亞病毒顆粒實驗顯示，ARF4敲除幾乎完全阻斷了病毒包膜蛋白E的分泌。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ARF4缺失會導致病毒顆粒滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)體囊泡中，無法正常轉(zhuǎn)運至高爾基林；冷凍-解凍實驗進一步排除病毒組裝缺陷的可能性，將研究重點聚焦于運輸障礙。免疫熒光分析結(jié)果表明，ARF4缺失會破壞病毒E蛋白與高爾基體標記物的共定位，同時降低跨高爾基體網(wǎng)絡中prM蛋白的切割效率。由此可見，ARF4通過介導病毒囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的定向轉(zhuǎn)運，確保病毒顆粒正確分選、成熟及釋放，其失活導致病毒滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并錯誤分選至溶酶體降解。

圖3：ARF4調(diào)控ZIKV的細胞內(nèi)運輸和釋放

• ARF4缺失導致病毒顆粒被溶酶體降解

研究團隊通過構(gòu)建穩(wěn)定表達ZIKV重組亞病毒顆粒（RSPs）的細胞系，發(fā)現(xiàn)ARF4缺失幾乎完全阻斷了RSPs的分泌。電鏡和生化分離實驗進一步證實，ARF4缺失會導致病毒顆粒在細胞內(nèi)的運輸過程受阻，無法正常抵達高爾基體，反而被錯誤地導向溶酶體降解。上述結(jié)果進一步表明，ARF4在ZIKV出芽過程中，對病毒顆粒的細胞內(nèi)運輸起到協(xié)調(diào)作用，以確保其正確分泌。

圖4：ARF4缺失導致病毒顆粒被溶酶體降解

• ARF4TP-4通過抑制ARF4的激活來抑制ZIKV感染

基于VXPX保守基序的理性設計，研究團隊設計并成功開發(fā)出一系列靶向ARF4的功能性多肽（ARF4-Targeting Peptides 1-5, ARF4TPs 1-5），其中ARF4TP-4多肽展現(xiàn)出最佳的抑制活性。體外實驗表明，ARF4TP-4可有效抑制ZIKV的復制，不會對宿主細胞的增殖產(chǎn)生影響；在小鼠體內(nèi)實驗中，連續(xù)給藥7天未引發(fā)肝腎毒性或免疫原性反應，同時可使感染小鼠的病毒載量下降超過2個數(shù)量級。此外，這種靶向宿主因子的干預策略不僅對ZIKV有效，對同屬黃病毒科的登革病毒和西尼羅病毒也表現(xiàn)出交叉抑制活性，為開發(fā)廣譜抗病毒藥物的開發(fā)提供了新的思路。

圖5. ARF4TP-4通過抑制ARF4的激活來抑制ZIKV感染

• ARF4具有廣譜抗病毒特性

由于ARF4是調(diào)控多種RNA病毒復制的核心宿主因子，在Vero細胞模型中，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除ARF4后，甲型流感病毒（IAV）、SARS-CoV-2及水皰性口炎病毒（VSV）的復制效率均顯著降低，這表明ARF4是跨病毒科的廣譜依賴宿主因子。在小鼠感染模型中，ARF4雜合敲除（ARF4+/?）小鼠在感染 IAV 后的生存率顯著提升（75% vs野生型25%），同時使肺和氣管中的病毒載量分別下降87%和68%。上述結(jié)果表明，ARF4具有廣譜抗病毒作用。

圖6：ARF4具有廣譜抗病毒作用

03. 結(jié)論

本研究揭示了ARF4作為調(diào)控寨卡病毒、流感病毒和新冠病毒等多種致病RNA病毒細胞內(nèi)運輸?shù)年P鍵宿主因子的重要作用。RNA病毒通過激活ARF4，實現(xiàn)子代病毒顆粒向高爾基體的定向轉(zhuǎn)運與釋放；而抑制ARF4活性，則會致使病毒顆粒被錯誤分選至溶酶體降解途徑。無論是通過基因敲除手段，還是利用靶向ARF4激活的小分子肽進行干預，均可顯著抑制病毒復制。在小鼠模型實驗中，相關干預措施對寨卡病毒和流感病毒感染展現(xiàn)出強大的保護作用，這為開發(fā)廣譜抗病毒藥物提供了全新靶點和治療策略。該發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)病毒靶向療法的局限性，為基于宿主因子動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡的抗病毒策略開發(fā)，提供了全新范式。

參考文獻

Nat Microbiol. 2025 Mar;10(3):710-723.