海馬作為大腦重要的結(jié)構(gòu)之一，其在學(xué)習(xí)、空間記憶及情緒調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮極其重要的作用。哺乳動物大腦的海馬包括三個(gè)主要的區(qū)室:海馬固有區(qū)，可分為三個(gè)錐體亞區(qū)[cornu ammonis(CA)]、齒狀回(DG)和海馬下托（subiculum）。在胚胎和出生后早期階段，各種不同類型的細(xì)胞需要精確地產(chǎn)生、遷移和組裝以產(chǎn)生一個(gè)功能性海馬。其中，DG的形成依賴于不同位置相繼出現(xiàn)的生發(fā)灶，這些生發(fā)灶在DG的不同部位產(chǎn)生顆粒細(xì)胞。發(fā)育過程中的細(xì)胞特化需要轉(zhuǎn)錄因子(TFs)、表觀遺傳因子和順式作用元件的協(xié)同作用，以確保精確的基因表達(dá)和沉默。發(fā)揮胚胎發(fā)生、器官發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子是抑制性組蛋白修飾，它包括H2AK119ub1，H3K27me3等，由PRC1和PRC2修飾。KDM2B包含兩個(gè)主要的異構(gòu)體，且都具有CxxC鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域，CxxC ZF是發(fā)揮將PRC1募集到非甲基化CpG島（CGIs）作用的關(guān)鍵成分。

2023年10月，武漢大學(xué)周嚴(yán)教授課題組在Nature Communications（IF=16）發(fā)表了題為“KDM2B regulates hippocampal morphogenesis by transcriptionally silencing Wnt signaling in neural progenitors”的研究論文。該研究采用Kdm2b^fl/fl，Emx1-Creand Nestin-Cre以及集萃藥康來源的B6/JGpt-Rnf2^fl/fl/Gpt小鼠，進(jìn)行了表型分析，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，RNA-seq和ChIP-seq分析等，揭示了KDM2B在海馬形態(tài)發(fā)生中的關(guān)鍵作用，并闡明了其通過轉(zhuǎn)錄沉默Wnt信號通路來調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞的機(jī)制。這一研究為深入理解海馬發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)功能提供了重要的啟示。

1.敲除KDM2B-CxxC導(dǎo)致海馬發(fā)育不全

首先，作者靶向編碼KDM2B-CxxC鋅指結(jié)構(gòu)域的75個(gè)氨基酸的外顯子13，制作了Kdm2b^flox(CxxC)小鼠，并分別與Emx1-Creand Nestin-Cre小鼠雜交，產(chǎn)生Kdm2b^Emx1-ΔCxxC and Kdm2b^{Nestin-ΔCxxC}兩種條件性敲除小鼠模型（cKO）以去除KDM2B在發(fā)育中的背端腦祖細(xì)胞中染色質(zhì)關(guān)聯(lián)能力。Kdm2b^{Nestin-ΔCxxC}在P7天前死亡，而Kdm2b^Emx1-ΔCxxC小鼠與野生相比生存情況無明顯異常。經(jīng)過進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示cKO成年小鼠的腦部海馬顯著變小、調(diào)節(jié)突觸可塑性和記憶的Calbindin表達(dá)細(xì)胞、NeuN⁺顆粒細(xì)胞、GFAP⁺SOX2⁺神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）等顯著減少。部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，不規(guī)則和異位分散等。結(jié)果表明，KDM2B在發(fā)育的前腦背側(cè)染色質(zhì)關(guān)聯(lián)能力的消融導(dǎo)致海馬發(fā)育不全，而成年cKO新皮質(zhì)的變薄可能繼發(fā)于腦室擴(kuò)張。

圖1.KDM2B-CxxC的缺失導(dǎo)致海馬發(fā)育不全

2、Kdm2b^ΔCxxC小鼠表現(xiàn)出記憶和學(xué)習(xí)缺陷

由于海馬對學(xué)習(xí)、空間導(dǎo)航、記憶鞏固以及探索等行為極其重要，因此，作者進(jìn)行了一系列行為測試。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示cKO小鼠存在空間學(xué)習(xí)缺陷，環(huán)境聲誘導(dǎo)恐懼條件反射測試中cKO小鼠的僵直時(shí)間均為延長。旋轉(zhuǎn)棒性能測試表明，cKO小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)和學(xué)習(xí)能力受損。礦場試驗(yàn)顯示cKO小鼠不愿探索開闊場地的中心區(qū)域。一系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，KDM2B染色質(zhì)關(guān)聯(lián)能力的減弱導(dǎo)致海馬發(fā)育失敗，這可能導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)缺陷。

圖2.Kdm2b^Emx1-ΔCxxC小鼠在空間記憶、情境恐懼條件反射和運(yùn)動學(xué)習(xí)方面表現(xiàn)出缺陷

3、KDM2B-CxxC缺失阻礙神經(jīng)發(fā)生和遷移

為了探究KDM2B-CxxC缺少對DG神經(jīng)的影響，作者進(jìn)一步通過EdU標(biāo)記細(xì)胞的分布并統(tǒng)計(jì)了表達(dá)特定神經(jīng)標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)量，觀察了中間祖細(xì)胞和神經(jīng)元沿遷移路徑的分布，排除了星形細(xì)胞支架缺陷導(dǎo)致的中間祖細(xì)胞（IPCs）遷移缺陷的可能性。Kdm2b^{Nestin-ΔCxxC}小鼠的觀察結(jié)果與Kdm2b^Emx1-ΔCxxC小鼠的觀察結(jié)果幾乎相同，即TBR2⁺IPCs在DNe和DMS顯著積累，但在DG中數(shù)量減少。這表明，KDM2B-CxxC的缺失導(dǎo)致的IPCs遷移缺陷不是由于皮質(zhì)下緣（CH）來源的星形細(xì)胞支架的缺陷引起的。因此，KDM2B-CxxC的缺失阻礙了IPCs的遷移，進(jìn)而影響了顆粒神經(jīng)元的產(chǎn)生和定位，從而影響了海馬形成過程。

圖3.KDM2B-CxxC缺失時(shí)神經(jīng)祖細(xì)胞分化受阻

4、KDM2B -ΔCxxC異常激活HP中的Wnt信號

為了進(jìn)一步探究KDM2B缺失導(dǎo)致海馬發(fā)育不全的分子機(jī)制，作者收集了P0對照和Kdm2b^Emx1-ΔCxxC小鼠大腦的海馬組織并進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示cKO小鼠的海馬中有886個(gè)基因被激活，575個(gè)基因被抑制。其中發(fā)現(xiàn)，cKO海馬中Pax6、Neurog2和TBR2/Eomes等祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平升高。GO分析顯示，上調(diào)的基因包括了與形態(tài)發(fā)生、典型Wnt信號通路等相關(guān)基因，而下調(diào)的基因包括了與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證cKO小鼠海馬中典型的Wnt信號增強(qiáng)，作者將CKO小鼠與BAT-GAL [B6.Cg-Tg(BAT-lacZ)3Picc/J] Wnt報(bào)告小鼠雜交。β -半乳糖苷酶染色顯示P0 cKO海馬具有較強(qiáng)的典型Wnt活性，包括CA區(qū)和FDJ區(qū)。典型Wnt信號基因如Lef1和Sfrp2的成分升高。表明了KDM2B -ΔCxxC異常激活HP中的Wnt信號。

圖4.KDM2B-CxxC的缺失導(dǎo)致海馬Wnt信號通路的激活

5、KDM2B在海馬發(fā)育過程中抑制Wnt信號通路基因的組成部分

KDM2B是PRC1變體的關(guān)鍵組成部分，介導(dǎo)抑制組蛋白修飾。為了探究KDM2B-CxxC的缺失如何影響海馬組織的修飾，以及與增強(qiáng)的Wnt信號通路的關(guān)系。作者使用ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，cKO海馬組織和神經(jīng)球中H2AK119ub和H3K27me3的總體水平下降。RT-qPCR結(jié)果顯示，cKO海馬中的多個(gè)Wnt配體以及Sfrp2均顯著升高。

圖5.KDM2B在海馬發(fā)育過程中抑制Wnt信號通路基因的組成部分

6、Ring1B缺失不引起祖細(xì)胞積累

KDM2B將PRC1.1的其他組成部分，包括泛素蛋白連接酶Ring1B（編碼基因?yàn)?em>Rnf2），招募到CGIs來啟動和穩(wěn)定基因沉默。為了探究PRC1的功能失調(diào)是否導(dǎo)致了Kdm2b cko海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移和分化障礙。作者將Rnf2-flox小鼠與Emx1-Cre小鼠雜交，獲得了Rnf2^Emx1-cKO小鼠。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Rnf2^Emx1-cKO小鼠P0天H2AK119ub、H3K27me3的水平均有所下降，海馬區(qū)比對照組小，海馬中TBR2⁺祖細(xì)胞數(shù)量以及在DGs中的分布明顯減少。然而，海馬的FDJ區(qū)沒有TBR2⁺IPCs的聚集和分散。因此，雖然PRC1的功能喪失也會導(dǎo)致海馬發(fā)育不全，但并不會導(dǎo)致海馬發(fā)育的遷移路徑中神經(jīng)祖細(xì)胞的形成。盡管Wnt通路和神經(jīng)發(fā)生基因在Kdm2b^Emx1-ΔCxxC海馬中上調(diào)，但在Rnf2^Emx1-cKO海馬組織中，它們沒有顯著改變。表明了，KDM2B-CxxC的缺失減少了關(guān)鍵Wnt信號基因的抑制性組蛋白修飾，從而導(dǎo)致Wnt激活延長，從而阻礙海馬祖細(xì)胞的分化和遷移。

圖6.Ring1B缺失不引起祖細(xì)胞積累

結(jié)論

這篇論文主要研究了KDM2B在調(diào)節(jié)海馬體形態(tài)發(fā)生中的作用。KDM2B-CxxC的缺失導(dǎo)致抑制性組蛋白修飾減少，Wnt信號通路被激活，從而阻礙海馬體前體細(xì)胞的正常遷移和分化。