對(duì)于普通的轉(zhuǎn)基因，表達(dá)的區(qū)域?qū)⑷Q于啟動(dòng)子。如果選擇全身表達(dá)的啟動(dòng)子，如CAG、EF1α、CMV等將得到全身表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠；如果選擇一些組織特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，將得到組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，如在AP2的promoter啟動(dòng)下進(jìn)行表達(dá)，會(huì)得到脂肪組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。需要特別說明的是，轉(zhuǎn)基因的策略是將轉(zhuǎn)基因片段直接注射到小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)基因片段將會(huì)在小鼠基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入，因?yàn)槭峭耆S機(jī)的，有可能會(huì)插入到一些抑制區(qū)導(dǎo)致轉(zhuǎn)入的基因不表達(dá)，也有可能插入到一些增強(qiáng)區(qū)導(dǎo)致轉(zhuǎn)入的基因高表達(dá)，通常會(huì)出現(xiàn)在小鼠基因組中多拷貝插入的現(xiàn)象。通過原核注射的方法得到的第 一代轉(zhuǎn)基因小鼠稱為 founder（首建鼠），由于上述隨機(jī)性，每一只founder都是不一樣的，以每一只founder起源構(gòu)建得到的可穩(wěn)定遺傳的品系稱為line，不同的line之間的表達(dá)由于實(shí)際插入位點(diǎn)的不同和/或插入拷貝數(shù)的不同會(huì)有差異。首建鼠與首建鼠之間不應(yīng)該相互交配。

若目標(biāo)基因是生殖發(fā)育相關(guān)的重要基因，則全身敲除該基因后可能會(huì)導(dǎo)致陽性鼠死亡或陽性鼠無法遺傳。如果事先已知基因的功能，可采用條件性敲除的設(shè)計(jì)方案。

如果基因有過表達(dá)致死或影響生殖的情況，則過表達(dá)模型（轉(zhuǎn)基因或者安全位點(diǎn)敲入等）可能會(huì)發(fā)生表型，導(dǎo)致無法獲得陽性小鼠，或陽性鼠無法遺傳。如果事先已知基因的功能，可采用誘導(dǎo)表達(dá)的設(shè)計(jì)方案。

顯性負(fù)效突變(Dominant negative mutation)類模型，雜合子小鼠便會(huì)出現(xiàn)表型，如果表型嚴(yán)重到影響到鼠生殖和發(fā)育的，可能無法獲得陽性小鼠，或陽性鼠無法遺傳。如果事先已知基因的功能，可采用誘導(dǎo)表達(dá)突變的設(shè)計(jì)方案。

插入在N端還是C端要結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域和蛋白的定位情況來綜合考慮。插入位置盡量要避開蛋白重要的結(jié)構(gòu)域，如果N端有分泌信號(hào)肽，可選擇插入在基因的C端，但若實(shí)在需要插入在N端，可插入到信號(hào)肽的后面，但需要考慮插入外源序列后對(duì)信號(hào)肽切割效率的影響，此時(shí)可用 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 或類似的信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行事先預(yù)測(cè)評(píng)估。

我們?cè)谠O(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因或敲入小鼠模型的時(shí)候，如果表達(dá)的目標(biāo)基因跟小鼠內(nèi)源基因相同，或目前市面上沒有較好的抗體來檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)時(shí)，可在設(shè)計(jì)載體時(shí)加入Tag。有多種標(biāo)簽可選擇用于標(biāo)記目的蛋白，常用的小標(biāo)簽有HA、Flag、Myc、His等，可用于蛋白檢測(cè)、免疫沉淀等生化應(yīng)用；常用的熒光蛋白有GFP、RFP、mCherry 、tdTomato等，可用于蛋白定位（包括亞細(xì)胞定位）和活細(xì)胞成像等（需要注意，通過2A肽段編碼序列或IRES間隔的熒光蛋白不與目的基因表達(dá)產(chǎn)物形成融合蛋白，因此不能起到標(biāo)簽的效果，不能反應(yīng)蛋白的亞細(xì)胞定位或作為標(biāo)簽使用，僅能標(biāo)示目的基因的時(shí)序性和組織特異性表達(dá)）。需要注意的是，Tag加入后可能會(huì)對(duì)基因的表達(dá)或蛋白的功能產(chǎn)生無法預(yù)期的影響，一般來說蛋白標(biāo)簽分子越大，影響可能會(huì)越大。

F0代或嵌合體小鼠中的修飾基因非穩(wěn)定可遺傳，可能生殖系細(xì)胞并未被進(jìn)行編輯因而無法遺傳獲得陽性后代；可能在一只鼠身上存在多種不同的編輯類型，導(dǎo)致傳代后的小鼠基因型不正確或存在多種不同的基因型；每只F0代鼠的情況均不同。為了得到穩(wěn)定可遺傳的基因編輯小鼠，需要將F0代或嵌合體與野生型背景小鼠回交，得到陽性F1代雜合子。轉(zhuǎn)基因品系由于存在多位點(diǎn)多拷貝隨機(jī)插入的情況，F(xiàn)0代founder鼠可能需要回交多代才能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。

在各類項(xiàng)目的載體構(gòu)建的階段，每一步都需經(jīng)過PCRà酶切à測(cè)序的過程，確保載體的正確性。

在小鼠階段，采用對(duì)5-7天的小鼠進(jìn)行剪尾鑒定，同樣是經(jīng)過PCR測(cè)序的檢測(cè)過程, 保證KO/CKO/KI模型正確中靶，并且中靶序列正確。KI類模型還有嚴(yán)格的拷貝數(shù)檢測(cè)，確保除了正確中靶的序列外，無額外的隨機(jī)插入片段。

我們最終會(huì)為客戶提供至少3只經(jīng)過鑒定為陽性的雜合子小鼠（轉(zhuǎn)基因?yàn)橹辽?只founder小鼠）。在項(xiàng)目完成得到足夠數(shù)量的雜合子小鼠后，我們會(huì)將該項(xiàng)目的項(xiàng)目完成報(bào)告、小鼠使用手冊(cè)、鑒定體系說明一并發(fā)送給客戶。

交付基因型正確的SPF級(jí)小鼠。

檢測(cè)前一天更換墊料，稱取新飼料并替換原來的飼料。24小時(shí)后再次稱取籠架上以及籠盒內(nèi)掉落的大塊飼料重量，二者的差值即為此籠小鼠24小時(shí)的攝食量，以此總量除以此籠內(nèi)小鼠的數(shù)量即為每只小鼠的24小時(shí)平均攝食量。攝水量的檢測(cè)方式類似。