1、PCR假陰性（擴增條帶弱或無條帶）

A 特征

● 樣品目的條帶無法擴增或條帶弱；

● 陽性對照同樣沒有條帶或條帶極弱；

B  原因

● 目的片段條帶過大導(dǎo)致擴增效率低；

● DNA模板質(zhì)量較差或擴增體系不合適（擴增酶擴增效率不高或PCR程序不合適等）；

● PCR儀溫控模塊差異；

C  解決方式

● 設(shè)計備用引物，盡量縮短PCR產(chǎn)物大?。?/p>

● 使用試劑盒提取純化DNA模板或優(yōu)化鑒定體系（建議參照集萃藥康推薦的程序進行鑒定）；

● 可嘗試使用三步法PCR程序進行擴增，同時由于儀器、操作等環(huán)節(jié)依然存在變量，若上述處理無法改善，建議梯度測試最優(yōu)退火溫度。

2、PCR假陰性（泳道彌散狀、伴隨核酸掛孔或較嚴重的引物二聚體現(xiàn)象）

A  特征

● 膠孔大量發(fā)光，DNA無法脫離膠孔；

● 泳道出現(xiàn)彌散狀抹帶，通常伴隨掛孔現(xiàn)象；

● 在膠圖的最下方，常有比較明顯的非目的條帶；

B  原因

● DNA通過堿裂解、一步法試劑盒提取，未經(jīng)純化使用，蛋白裹在核酸上，導(dǎo)致核酸無法跑出膠孔；

● DNA模板附著較多雜質(zhì)，影響引物的退火結(jié)合；

● 彌散的泳道通常為一些降解的核酸片段；

C  解決方式

● 重新純化提取DNA或稀釋DNA模板（降低雜質(zhì)比例）；

● 更換備用引物或者使用高效率的擴增酶；

● 及時電泳，避免擴增產(chǎn)物長時間存放室溫或4℃冰箱。

3、PCR假陽性（出現(xiàn)擴增污染）

A  特征

● 陰性對照、空白對照出現(xiàn)不符合預(yù)期的條帶，通常會稍弱于陽性樣品的主帶，偶有與主帶完全相同的亮度；

● 常發(fā)生于PCR產(chǎn)物小于500bp的反應(yīng)中，產(chǎn)物越小，污染可能性越高；

B  原因

● 樣品交叉污染，包括DNA模板、擴增體系配置或者電泳時污染；

● 氣溶膠污染，少量樣品鑒定時偶發(fā)，大批量樣品鑒定、或者長時間使用同一對引物鑒定時發(fā)生頻率明顯增高；

C  解決方式

● 輕微污染時，提高退火溫度、減少3-5循環(huán)、稀釋DNA模板同時進行；

● 污染嚴重時，重新設(shè)計備用引物檢測，條帶不小于500bp，同時使用上述調(diào)整體系。

4、PCR特異性差（存在非特異性條帶）

A  特征

除目的條帶外，存在其他特異性擴增的產(chǎn)物，有時非特異性產(chǎn)物與目的帶接近，影響結(jié)果判定；

B  原因

● 引物不特異；

● 酶的效率太強、退火溫度偏低、退火延伸時間過長；

C  解決方式

● 非特異性擴增條帶較弱時，提高退火溫度、減少3-5循環(huán)、稀釋DNA模板同時進行，可有效抑制非特異性擴增；

● 非特異性擴增條帶較強時（雜帶亮度與目的帶幾乎一樣或者更亮），重新設(shè)計PCR引物。

5、PCR優(yōu)勢擴增

A  特征

被檢個體處于雜合狀態(tài)時，有時會出現(xiàn)較短片段等位基因擴增產(chǎn)物高于或低于較長片段擴增產(chǎn)物，甚至可能有一條帶完全無法擴增；

B  原因

● 當一個PCR反應(yīng)中存在超過一種產(chǎn)物時，不同的產(chǎn)物會存在競爭性擴增，導(dǎo)致其中一種產(chǎn)物的產(chǎn)量遠大于其他產(chǎn)物；

● 通常小條帶比大條帶更容易擴增，且兩條帶差距越大，優(yōu)勢擴增現(xiàn)象越明顯；

● 個別情況下，比如產(chǎn)物序列存在特殊結(jié)構(gòu)，也會出現(xiàn)大條帶優(yōu)勢擴增現(xiàn)象；

C  解決方式

集萃藥康鑒定方案為避免優(yōu)勢擴增干擾，通常兩條帶差距超過300bp，會分別設(shè)計引物用于驗證，避免優(yōu)勢擴增出現(xiàn)。

6、電泳條帶彎曲

A  特征

電泳結(jié)果出現(xiàn)“笑臉狀條帶”；

B  原因

制備瓊脂糖凝膠時，煮沸后部分水分蒸發(fā)，導(dǎo)致瓊脂糖凝膠中的電泳液濃度，高于電泳槽中的電泳液濃度。此時膠孔中的PCR產(chǎn)物，中心區(qū)域遷移速率快，周圍靠近電泳液的產(chǎn)物遷移速率慢，展現(xiàn)出嚴重的彎曲；

C  解決方式

煮沸凝膠后，需要添加蒸餾水，補足蒸發(fā)的體積，需要注意緩慢添加，并同時均勻晃動，避免局部降溫過快，導(dǎo)致凝膠冷卻不均勻產(chǎn)生結(jié)塊。

7、實際電泳條帶與目的帶大小不符

A  特征

經(jīng)過與Marker或其他對照比較，實際膠圖上的目的帶與鑒定方案中標記的產(chǎn)物大小不符；

B  原因

● 凝膠問題（質(zhì)量較差、濃度較低）或者電泳時間不合適；

● Marker質(zhì)量問題；

● 序列更新或標記的產(chǎn)物大小有偏差；

C  解決方式

● 調(diào)整凝膠濃度、電泳條件等條件（建議參照集萃藥康推薦的電泳體系）；

● 更換合適品牌的Marker；

● 嘗試使用備用引物。

在同一個PCR反應(yīng)體系中，存在2種或兩種以上的PCR產(chǎn)物時，不同的產(chǎn)物擴增效率存在差異，即為PCR的優(yōu)勢擴增現(xiàn)象（如圖示1，產(chǎn)物②的擴增效率明顯高于產(chǎn)物①)。

圖示 1

表現(xiàn)形式：

當兩種產(chǎn)物的GC含量接近、產(chǎn)物中都不存在特殊結(jié)構(gòu)且延伸時間足夠時，小條帶的擴增效率高于大條帶的擴增效率。

產(chǎn)生原因：

①由于Taq酶在反復(fù)的變性-退火-延伸過程中，酶的活性在持續(xù)降低（通常35-40循環(huán)后酶完全失活），而20-40循環(huán)中隨著酶活的降低，大片段產(chǎn)物的延伸富集效率也大大降低，而小片段的延伸效率受影響較小，故PCR循環(huán)中，小片段產(chǎn)物的擴增含量將遠大于大片段的產(chǎn)物；

②部分反應(yīng)體系中，引物對于模板的敏感性較低，若在PCR循環(huán)的初始階段（前5-10循環(huán)），已經(jīng)產(chǎn)生了大量的小片段產(chǎn)物富集，那么后續(xù)的循環(huán)中，大多數(shù)反應(yīng)會以小片段的產(chǎn)物作為模板進行擴增；

以上兩個因素疊加，導(dǎo)致小片段產(chǎn)物的含量遠大于大片段產(chǎn)物的含量（可達指數(shù)級的差異），

故電泳時，小條帶亮度將遠大于大條帶的亮度，甚至完全無法檢測到大條帶的存在。

優(yōu)化方案：

將鑒定不同基因型的反應(yīng)，分別進行PCR擴增，即在設(shè)計PCR方案時，優(yōu)選每種產(chǎn)物的特異性驗證方案（通常判斷最小條帶為有效擴增條帶，大條帶無論是否擴增成功，由于存在風險較大，不作判斷使用）。

其他調(diào)整方案：①更換品牌更佳的taq酶，讓高循環(huán)數(shù)時的酶活盡量保持最 佳狀態(tài)；②更換擴增引物，盡量避免低循環(huán)的產(chǎn)物富集。

特殊情況：

在兩種產(chǎn)物的片段存在結(jié)構(gòu)上的差異、或存在明顯的GC含量區(qū)別時，優(yōu)勢擴增的產(chǎn)物將變?yōu)镚C均勻、且不含高級結(jié)構(gòu)的那份產(chǎn)物，此效率甚至可以覆蓋上述條帶所產(chǎn)生的擴增效率差異。如圖示2所示，產(chǎn)物①的GC含量均勻，但產(chǎn)物②的GC含量極高，所以即使產(chǎn)物②條帶遠小于產(chǎn)物①,但擴增效率仍然是產(chǎn)物①更高。

圖示 2

什么是核酸氣溶膠污染？

核酸氣溶膠污染， 即 DNA/RNA 氣溶膠污染，是實驗室中極易出現(xiàn)的一種空氣污染。空氣與液體的液面摩擦， 離心機離心，劇烈搖動反應(yīng)管， PCR 開蓋，移液器反復(fù)吸樣， 污染物外泄等情況均會產(chǎn)生核酸氣溶膠 。這類污染的危害對于 PCR 實驗結(jié)果尤其顯著 ：極微量的核酸氣溶膠污染, 即可形成 PCR 擴增假陽性。

氣溶膠污染的表現(xiàn)形式：

● PCR 實驗中， 以去離子水為模板的 PCR 產(chǎn)物， 也可以擴增出目的條帶， 在排除體系污染 、樣品間交叉污染的情況下， 即可認為存在氣溶膠污染；

● 由于此類污染的 PCR 擴增模板實際為游離的氣溶膠核酸片段， 通常情況下為核酸碎 片 ， 且含量極低， 對于大片段的 PCR 擴增影響較小， 故通常出現(xiàn)在 PCR 產(chǎn)物大小在80-500bp 的 PCR 反應(yīng)中。

氣溶膠污染的預(yù)防及清理措施：

● 良好的實驗習(xí)慣： PCR 實驗前， 使用 75%乙醇， 進行桌面 、移液器的擦拭； 實驗過程 中 ， DNA 提取 、 引物溶解 、 PCR 體系配置時，盡量避免劇烈震蕩， EP 管的開關(guān)盡量輕柔，如發(fā)生樣品飛濺時，及時使用 75%乙醇擦拭 2 次。

● 實驗室環(huán)境控制 ：保持每天至少 4 個小時的通風， 尤其是冬夏開空調(diào)時期， 氣溶膠污染高發(fā)。

● 當已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣溶膠污染時， 除了上述操作外， 我們會每天增加 8 小時的紫外照射， 并 開啟實驗室的負壓通風裝置， 由于氣溶膠污染的頑固性， 通常 3 -4 周， 才可以完全清 除 。 而對于進行中的 PCR 實驗， 我們建議在超凈臺/通風櫥進行 PCR 實驗， 開封新的試劑 、耗材（EP 管 、 引物 、酶 、 去離子水等） ， 由于氣溶膠核酸片段不完整 、含量較 低， 所以提高 PCR 程序中的退火溫度， 同時降低 3 -5 個循環(huán)， 效果也比較明顯； 條件 允許時， 可以嘗試更換 PCR 擴增區(qū)域， 將擴增片段控制在 800bp 左右， 也可以有效避免此類問題。

NCG是使用基因編輯技術(shù)敲除了NOD/ShiltJGpt小鼠的Prkdc（Protein kinase, DNA activated, catalyticpolypeptide）及 Il2rg（Common gamma chain receptor）基因而獲得的重度免疫缺陷品系。Prkdc基因功能缺失造成T細胞和B細胞不能發(fā)育成熟。IL2RG是多種白細胞介素細胞因子受體的共同亞基，IL2RG失活則導(dǎo)致多種不同細胞因子信號通路缺失，造成NK細胞缺陷。因此，NCG是迄今為止免疫系統(tǒng)缺陷最為徹底的小鼠模型之一，缺乏成熟的T細胞、B細胞和NK細胞，暫未出現(xiàn)隨著年齡的增長有免疫細胞滲漏的情況。