好不容易設(shè)計的課題，卻卡在模型構(gòu)建上？配繁不生、鑒定不準(zhǔn)、策略復(fù)雜……這些坑你是不是也正在經(jīng)歷？別急，這篇避坑指南+寶藏手冊能幫你破局！

基因工程小鼠模型已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心工具，尤其在解析基因功能、疾病機制和藥物驗證中不可或缺。而條件性敲除/敲入（CKO/CKI）模型，憑借其“時空特異性”操控基因的能力，更是成為了組織特異性研究的不二之選。

• 組織特異性——精準(zhǔn)在肝、腦等靶器官中敲除致病基因，避免全身性敲除帶來的發(fā)育致死。

•  時間可控性——通過他莫昔芬（Tamoxifen）等誘導(dǎo)劑控制Cre酶活性，實現(xiàn)在特定時間點敲除基因。

然而，從策略設(shè)計到最終獲得可靠模型，一路可謂坑坑洼洼。想要順利通關(guān)，必須攻克以下三大難點！

難點1：繁育策略設(shè)計——多基因交配的“迷宮困局”

第一步繁育策略就讓人頭大，以CKO/CKI模型為例，通常配繁策略需從配繁周期、目標(biāo)子代獲取比例、對照獲取情況等多角度考慮。傳統(tǒng)的“先獲得flox純合，再與Cre鼠交配”策略，不僅耗時漫長，還需額外建立對照組，費時費鼠。

高效策略推薦：同步配繁，事半功倍~

難點2：繁育效率黑洞——母鼠不生、吃仔、棄養(yǎng)連環(huán)暴擊

策略對了，生不出來也是白搭。繁育環(huán)節(jié)的“黑天鵝”事件，分分鐘讓科研人崩潰。

不生？——可能是“婚配”方式不對

首先確保小鼠處于最佳育齡，一般雌鼠6周齡、雄鼠8周齡性成熟，超過6月齡生殖能力開始下降，若出現(xiàn)不孕不育現(xiàn)象，建議優(yōu)先確認(rèn)繁殖籠小鼠的周齡和健康狀態(tài)。通常按每籠1雄配2雌進(jìn)行繁殖籠配置，若長期未見生仔（1~1.5個月）可以嘗試將各籠雄雌鼠互換，或者雄鼠單放休息幾天后再合籠。一般來說,至少需要2~4 對育齡小鼠進(jìn)行繁育。若特殊品系有生育缺陷表型或需要加快繁育速度,可以擴大繁殖籠數(shù)量。

吃仔棄養(yǎng)？——環(huán)境與操作是關(guān)鍵

母鼠初次產(chǎn)仔，或籠盒內(nèi)外環(huán)境異常時均有可能增加食仔或不帶仔的概率。此外，人為的干擾（如沾到消毒劑、頻繁抓?。┑仍?，均有可能導(dǎo)致小仔攜帶“異味”，從而出現(xiàn)棄養(yǎng)現(xiàn)象。因此，在確保帶仔小鼠飼養(yǎng)環(huán)境適宜的情況下，需盡量減少對小鼠的操作，并及時觀察籠盒內(nèi)母鼠及小仔情況，若發(fā)現(xiàn)食仔或不帶仔情況，也可考慮用相近時期合籠且母性較好的品系進(jìn)行代乳操作。（操作建議詳見文末手冊）

難點3：鑒定準(zhǔn)確性崩塌——結(jié)果不可重復(fù)的元兇

千辛萬苦等到小鼠出生，基因型鑒定結(jié)果卻一團(tuán)糟？假陽性和假陰性是拖慢進(jìn)度的終極殺手。

在鑒定時加入陽性對照、陰性對照及空白對照，能夠更好判斷鑒定結(jié)果是否準(zhǔn)確，而若對照結(jié)果異常，則提示鑒定結(jié)果存在偏差。

假陽性（空白對照出現(xiàn)條帶）？——警惕“氣溶膠污染”

若實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性，除排查試劑或耗材污染，還需警惕氣溶膠污染風(fēng)險。此類污染是PCR實驗室的噩夢——極微量核酸氣溶膠即可導(dǎo)致結(jié)果異常，且具頑固性。若已存在氣溶膠污染，可通過優(yōu)化程序：提高退火溫度并減少3–5個循環(huán)，或者更換擴增區(qū)域（建議片段≤800bp） 嘗試規(guī)避。當(dāng)然，保持潔凈實驗室環(huán)境與規(guī)范操作，才是杜絕此類問題發(fā)生的根本途徑。

假陰性（陽性對照沒條帶）？——模板/引物/程序是重點

PCR擴增效率與模板質(zhì)量、酶、引物、反應(yīng)程序均密切相關(guān)，需從四個方向逐一排查。但值得注意的是，某些實驗結(jié)果可能具備一定的迷惑性，例如：某案例使用兩對引物進(jìn)行擴增，其中200bp條帶擴增成功，而800bp未擴增出條帶，而優(yōu)化模版質(zhì)量后，問題得到解決。因此，核酸模版的質(zhì)控與保存也至關(guān)重要。

• 濃度與純度：推薦使用濃度為20-80 ng/μl，A260/A280比值在1.8-2.0之間的DNA模板。

• DNA保存條件：推薦TE溶解，短期（≤2周）可保存于4℃中，長期保存應(yīng)置于-20℃中，且避免反復(fù)凍融。

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